Ⅰ. INTRODUCTION

구강 편평세포암종(OSCC)은 구강 인두 및 후두의 점막 상 피에서 발생하는 악성 종양으로 전 세계적으로 HNSCC의 발 병률은 2030년까지 30% 이상 증가할 것으로 예상하고 있다. 특히, 구강암은 95% 이상이 편평세포암종으로 흡연, 음주, 만 성적 자극, HPV 바이러스 감염 등 식생활 및 사회적 환경의 변화로 증가하고 있는 추세에 있으며, 국내에서도 구강암에 의한 사망률 또한 계속적으로 증가하고 있다 [1]. 구강 편평세 포암의 경우 잠재 전이의 가능성이 12%∼50%로 타 암에 비해 높으며 특히 구강에서 발생하는 악성 종양은 전이 여부에 따 라 예후에 큰 차이를 보이고 있다. 실제로 경부 림프절 전이가 있는 경우는 생존율이 50% 정도 감소한다고 알려져 있으며, 재발이 60%에 이를 정도로 치료 및 예후가 좋지 않은 편이다 [2]. 최근 구강암 치료 연구는 암세포에 대한 선택성이 큰 세포 독성 약물의 개발과 지놈 프로젝트를 통한 유전정보의 획득으 로 파생되는 유전적 치료 및 유전자 재조합 단백질을 이용한 신규 생물요법 항암제 개발 그리고 부작용이 작은 광역학 치 료법으로 방향이 전환되고 있으나 실용 단계에 이르기까지는 많은 연구가 요구된다. 또한, 구강암은 multistep process을 통해 발생하는 것으로 보고 있으나, 정확한 발생 단계의 유전 학적, 분자생물학적 기전들은 많은 부분에서 아직 연구가 필 요한 실정이다.

Human homeobox C6 (HOXC6)는 배아 발달, 세포 형태 형성, 혈관신생 및 분화에서 중요한 역할을 하는 전사 인자로 잘 보존된 homeobox family 중에 하나이다. HOX gene family 의 발현 변화는 이들 단백질의 기능 장애를 일으켜 cell migration, invasion 그리고 proliferation을 유도하며, 전립선암, 유 방암, 간세포 암종, 위암, 대장암, 비뇨생식기암 발생에 관여한 다 [3]. 또한 구강 편평세포암종(OSCC) 환자에서 HOXC6의 발현이 정상조직에 비해 높게 나타나고 있으며, 사람 종양에서 높은 HOXC6 발현은 낮은 생존율 및 높은 재발과의 연관성을 보여주고 있다 [4-8]. 이는 비정상적인 HOXC6 유전자의 발현 이 OSCC 발암과정에 관여하고 있음을 보여주고 있다. 이전 연구에 따르면 HOXC6는 PI3K/AKT, Notch, TGF-β/smad 및 Wnt/β-catenin 경로와 같은 세포신호전달기전 조절을 통해 발 암 유전자로 작용하고 있으며 [9-12], 또한 구강암에서 HOXC6 의 유도가 Bcl-2의 발현을 조절함으로써 apoptosis를 유의하게 억제하는 것이 알려져 있다 [13]. HOXC6는 MDR1의 전사를 조절하여 cisplatin과 paclitaxel과 같은 항암제에 대한 내성을 유도한다 [14-15]. 최근 구강암 세포에서 HOXC6 유도 miRNA mir-188-5p가 종양 억제 유전자인 FOXN2의 발현을 억제하여 전이를 유도한다고 알려져 있으나 [16], 아직까지 구강암 세포 에서 HOXC6의 기본 메커니즘은 잘 밝혀지지 않고 있다.

Sirt1은 NAD+-dependent deacetylase로 histone 또는 non-histone protein의 deacetylation을 통해 mitochondrial 기 능 조절 및 에너지대사 조절에 관여하며, 또한 이들의 발현과 활성은 다양한 암 형성에 관여하고 있으나, Sirt1의 역할에는 논란의 여지가 있다 [17-18]. 따라서 본 연구의 목표는 구강암 세포에서 HOXC6 유전자 발현 상태와 치료적 가치를 조사하 고 그 발현과 관련된 분자생물학적 기전을 밝히는 것이다. 특 히, HOXC6와 Sirt1간의 상호작용 및 기전 연구를 통해 구강암 형성과정과 분자 기전을 규명하여 구강암 치료에 기초를 제공 할 수 있을 것이다.

Ⅱ. MATERIALS AND METHOD

1. Cell culture and Reagent

사람 구강암 세포인 FaDu, YD-8, YD-15는 10% Fetal bovine serum (FBS), 100 units/㎖ Penicillin 과 100 ㎍ / ㎖ Streptomycin을 함유한 Dulbecco’s modifies Eagle’s medium (DMEM, Welgene,.Inc,. Korea) 과 Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI1640, Welgene,.Inc,. Korea) 사 용하여 5% CO₂, 37℃에서 배양하였다. Sirt1 억제제 EX527은 Cayman Chemical (USA)에서 구입하였다.

2. Bioinformatics Analysis

TIMER (Tumor Immune Estimation Resource) 데이터베이 스를 사용하여 모든 TCGA 종양에 걸쳐 유전자에 대한 종양과 정상 조직 간의 차등 발현을 분석하였다. 유전자 발현 수준은 box plot을 사용하여 표시하였다. Wilcoxon 검정에 의해 계 산된 통계적 유의성을 표시하였다 (^*p < 0.05; ^**p < 0.01; ^***p < 0.001).

3. Microarray data and Analysis

RNA 순도를 OD 260/280 비율로 평가하고 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, USA)로 분석 하였다. 데이터는 Affymetrix GeneChip® Command Console® 소프트웨어 (AGCC)에서 제공하는 소프트웨어를 사용하여 Affymetrix 데이터 추출 프로토콜에서 자동으로 추 출하였으며 CEL 파일을 가져온 후 Affymetrix® Expression Console™ 소프트웨어(EC)에서 구현된 강력한 다중 평균 (RMA) 방법으로 데이터를 요약하고 정규화 하였다. 차별적으 로 발현된 유전자 (DEG) 분석을 수행하였으며 발현 데이터의 통계적 유의성은 배수 변화를 사용하였고 DEG 세트의 경우 계층적 군집 분석을 하였다. Prob 목록에 대한 Gene-Enrichment 및 Functional Annotation 분석은 Gene Ontology(www.geneontology. org/)를 사용하였으며 차별적으로 발현된 유전자 의 모든 데이터 분석 및 시각화는 R 3.1.2(www.r-project.org) 를 사용하였다.

4. Construction of the pGL3-Sirt1 Promoter

사람 Sirt1 유전자(GenBank 접근 번호 NC_000010.11)에서 ~1kbp 인간 Sirt1 프로모터 영역의 클로닝은 GoTaq® Long PCR Master Mix(Promega)를 사용하였으며, PCR 생성물을 제 한 효소 (KpnI 및 NheI)로 절단한 MEGAquick-spin plus kit (iNtRON Biotechnology, Korea)로 겔 정제하여 pGL3-Basic vector (Promega)에 subcloning 하였다.

5. Luciferase Reporter Assay

12well plate에 1x10⁵ cells /well로 seeding한 FaDu 세포에 polyethylenimine (PEI) transfection용액을 이용하여 empty pGL3-Basic vector (1 ㎍), pcDNA4 - HOXC6 plasmid (1 ㎍), pGL3 - Sirt1 promoter (1 ㎍)을 각각 transfection하였고 pGL3-Basic vector (0.5 ㎍) 와 pcDNA4 - HOXC6 plasmid (0.5 ㎍), pGL3 - Sirt1 promoter plasmid (0.5 ㎍) 와 pcDNA4 - HOXC6 plasmid (0.5 ㎍)을 co-transfection하여 48 시간 후 cell lysis buffer로 lysis하였다. Luciferase activity assay는 Luciferase Assay System (Promega)을 사용하여 프로토콜에 따라 시행하였다.

6. Transfection of the pcDNA4-HOXC6 and pCMV5-Sirt1 Plasmid

pcDNA4 - HOXC6 와 pCDNA3.1-Egfp-Flag-His-end plasmid는 (2 ㎍ DNA plasmid : 10 ㎕ PEI)로 polyethylenimine (PEI)을 사용하여 세포에 transfection하였다. Transfection 효 율을 확인하기 위해 48 시간 후 HOXC6의 mRNA 및 단백질 수준을 확인하였다. Electroporator는 Neon™ Transfection Kit (Invitrogen, Korea)를 사용하여 DMEM 배지(without antibiotic) 에서 1100 V, 1 pulse, 30 ㎳ pulse로 FaDu 세포에서 pCMV5 – Sirt1 plasmid를 transfection하기 위해 사용하였다. 24 시간 incubation 후 새로운 배지로 교체한 다음 24 시간 5% CO₂, 37 ℃에서 배양하였다.

7. Western Blotting Analysis

Protease inhibitor cocktail (1 ug / ㎖)이 포함된 RIPA buffer를 사용하여 단백질을 분리한 후 단백질 (30 ug / sample) 을 10% sodiumdodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel에서 전기영동 하였다. 단백질을 PVDF membrane (Millipore, Burlington, USA)으로 transfer하여 5% Skim milk로 2 시간 동안 blocking 후, HOXC6 (sc 376330), Sirt1 (sc 74465), CD109 (sc 271085) 및 β-actin (sc 47778) (1:1000) (Santa Cruz, CA, USA)은 4 ℃에서 overnight 하였다. 0.1% Tween® 20 (TBST)이 포함된 Tris-buffered saline으로 3회 세척한 후 HRP-conjugated secondary antibody (1: 2500) (Promega) 1 시 간 incubation하였다. Enhanced chemiluminescence (Clarity ™ Western ECL Substrate, Bio-Rad, Korea)를 사용하여 Amersham ImageQuant 800 Western blot 이미징 시스템으로 확인하였다.

8. Reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) analysis

총 RNA는 TRIzol Reagent (Invitrogen)로 추출하여 RNA 농 도는 Spectrophotometer Denovix Ds-11 Series (Denovix, USA)로 측정하였다. 핵산의 순도는 260 및 280 ㎚ 흡광도의 비율을 측정하고 광학 밀도 (OD 260/280)가 1.8에서 2.1 사이 인 것으로 평가하였다. 정량적 RT-PCR의 경우 cDNA 합성 및 qPCR은 GoTaq® Probe 1step RT-qPCR System (Promega)을 사용하여 프로토콜에 따라 시행하였다. HOXC6, Sirt1, CD109, PLK4, OXR1 및 GAPDH primer (Table 2)를 사용하여 100 ng /㎕ RNA, 10 ㎕ the GoTaq® qPCR Master Mix, 0.4 ㎕ GoScript™ RT Mix, 1 ㎕ Forward Primer, 1 ㎕ Reverse primer 및 Nuclease-Free Water를 총 20 ㎕ 로 만들어 RT-qPCR 을 수행하였으며 각 그룹의 세포주에서 유전자의 상대적인 발 현 수준은 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 계산하였다.

9. Cell proliferation assay

세포 증식을 분석하기 위해 MTT assay를 시행하였으며 12 well plate에 1 x 10⁵ cells/well로 seeding한 FaDu 세포에 pcDNA4 - HOXC6 plamid를 polyethylenimine (PEI)를 이용 하여 (2 ug DNA plasmid : 10 ㎕ PEI)로 세포에 transfection 하였고 EX 527 (Sirt1 억제제)은 0 - 50 μM 까지의 농도로 24 시간에서 48 시간 동안 처리하였다. Incubation 후, 세포를 PBS로 세척하고 MTT 용액 (5 mg/㎖)을 각 well에 첨가하였 다. Incubation에서 3 시간 배양한 후 MTT 용액을 제거하였고 insoluble formazan을 isopropanol (40 mM HCl in isopropanol) 에 용해시켜 흡광도를 DTX 880 Multimode detector (Beckman Coulter, Brea, CA, USA)로 540 ㎚에서 측정 하였다.

10. Wound-healing assay

6 well plate에 5 x 10⁵ cells/well로 seeding한 FaDu 세포 를 24 시간 incubation 후 tip을 사용하여 약 2 mm 스크래치 를 생성하여 pcDNA4 - HOXC6 plasmid를 polyethylenimine (PEI)을 사용하여 세포에 trasnfection 시킨 후 세포에 10 μM EX 527 (Sirt1 억제제)를 처리하였다. Olympus IX2-SLP inverted microscope (Olympus)를 이용하여 x40 배율에서 스크 래치 낸 직후에 사진을 촬영하였고 24 시간과 48 시간 후에 다시 촬영하여 대조군과 비교하였다.

11. Cell apoptosis assay

Apoptosis 분석을 위해 FaDu 세포를 PBS로 세척 후 DMEM 배지로 세포를 풀어 최종 세포 농도를 1 x 10⁶ cells/100 ㎕의 세포를 100 ㎕의 Muse Annexin V & Dead Cell Reagent (Thermo Fisher Scientific, Inc.)와 혼합하여 실 온의 어두운 곳에서 20분 동안 반응시켜 Guava Muse Cell Analyzer (Luminexcorp, USA)로 분석하였다.

12. Colony formation

세포를 polyethylenimine (PEI)으로 pcDNA4 – HOXC6를 transfection 후 10 μM EX527를 처리하여 각각의 well에 500 개 세포를 6 well plate에 seeding하였다. Colony 형성을 위해 incubator에서 7일 동안 배양한 후에 실온에서 20분 동안 10% 포르말린에 고정시키고 0.05% crystal violet으로 30분 동안 염색하였다. Colony는 CKX41 도립 현미경(Olympus, Japan) 에서 이미지화하고 카운트하였다.

13. Statistical analysis

데이터는 EXCEL을 이용하여 평균과 표준편차를 구한 후 두 그룹의 차이는 t-test를 이용하여 상호작용을 확인하였다. 이 연구의 통계학적 유의수준은 ^*p<0.05, ^**p<0.01로 하였다.

Ⅲ. RESULT

1. HOXC6 up-regulated in Heck and Neck Squamous cell carcinoma

TIMER(Tumor Immune Estimation Resource) database (http://timer.cistrome.org/)에 따르면 정상조직과 구강암을 포함하는 두경부암 조직을 비교하였을 때 HOXC6의 발현이 두경부암 조직에서 정상조직에 비해 유의성 있게 증가함을 확 인하였다 (Figure 1). 이들 결과는 이전 본 연구자의 연구에서 HOXC6가 여러 구강암 세포에서 과발현된 것과 일치한다. 구강암 세포에서 HOXC6의 작용기전을 확인하기 위해 구강암 세포인 FaDu 세포에 HOXC6를 과발현 시켜 RNA-Seq Analysis 를 시행하였다. 두 그룹에서의 발현되는 유전자들을 Cluster analysis-Hierarchical clustering heat map과 Scatter plot으로 확인하였으며 (Figure 2A-B), 그 결과 control FaDu 세포와 FaDu/HOXC6 세포 간에 유의성 있는 유전자들의 발현 차이 를 확인하였다. Bar plot-significant 그래프를 이용하여 분류 한 결과 이 중 3358개에서 1.5배 이상 발현이 증가하였고 1309개에서 2배 이상 발현이 증가하였다. 또한 2023개에서 1.5배 이상 발현이 감소하였고 148개에서 2배 이상 발현이 감 소하였다 (Figure 2C). RNA-Seq analysis 결과를 Gene Ontology (www.geneontology.org/)를 이용하여 분석한 결 과 HOXC6 과발현 시켜 FaDu 세포에서 생물학적 과정 중 HOXC6가 많은 cellular signaling에 상당 부분 관여하고 있음 을 확인하였다 (Figure 2D). HOXC6에 의해 up- 또는 down 조절 유전자 상위 30개를 각각 Table 1에 정리하였다.

2. Up-regulation of HOXC6 induces Sirt1 expression through transcription regulation

RNA-Seq analysis 데이터를 기반으로 유전자의 발현을 평 가하기 위해 HOXC6에 의해 증가하는 상위 10개의 표적 유전 자를 선택하였으며, 그 중 4개의 후보 유전자 Sirt1, CD109, PLK4, OXR의 발현을 평가하였다. 우선 이들 mRNA 발현은 FaDu 세포에 HOXC6를 48 시간 transfection 후 qRT-PCR을 확인하였다. Transfection 효율을 확인하기 위해 EGFP vector 를 함께 세포에 transfection 하였다. Sirt1, CD109, PLK4, OXR mRNA가 HOXC6의 과발현됨에 따라 유의성 있게 증가하였으 며 (Figure 3A-B), 반면 control과 EGFP vector를 transfection 시킨 세포 내에서는 유의성이 있는 변화가 나타나지 않았다. 특히, 다양한 암에서 Sirt1의 기능은 상반된 역할을 보이고 있 지만, Sirt1의 비정상적인 발현은 많은 인간 악성 종양에서 자주 보고되어 있다. 따라서, HOXC6와 Sirt1간의 상관관계를 이해하기 위해 HOXC6 과발현 FaDu 세포에서 HOXC6에 의한 Sirt1의 전사활성을 확인하기 위해 Sirt1 promoter (pGL3-luc-sirt1 (1.0 kb, from ATG start codon))를 이용하여 Luciferase assay를 시행하였다. pGL3-luc-sirt1 (1.0 kb) 단독 으로 transfection 시킨 FaDu 세포에서도 Sirt1의 전사활성이 유의성 있는 증가를 보였으나, HOXC6를 과발현 시킨 세포에 서 중요하게 Sirt1의 전사활성이 증가함을 확인하였다 (Figure 3C). TRANSFAC® 7.0 databases를 통해 Sirt1 promoter (1 kb) 내에 3개의 HOXC6의 binding element인 homobox binding motifs (TAAT)가 –971, -947, -521 bp에 존재함을 확인하였다. 또한 단백질 발현에서 HOXC6 과발현 시킨 FaDu 세포에서 Sirt1의 발현이 증가하였으며 (Figure 3D), 이들 결과는 HOXC6 가 Sirt1의 전사에 직, 간접적으로 관여하고 있음을 보여주고 있다.

3. Sirt1 inhibitor EX527 suppress invasion and proliferation of oral cancer cell lines

Sirt1은 전립선암, 유방암, 폐암 등 여러 악성 종양의 형성과 발달에 관여하고 있다 [31]. 본 연구에서는 구강암 세포주인 FaDu 세포에서 Sirt1이 carcinogenesis에 관여하는지 확인하 기 위해 Sirt1 억제제인 EX527을 사용하여 먼저 증식과 이동성 을 확인하였다. 그 결과 FaDu 세포에 EX527 (10 μM)를 48 시간 처리하였을 때 control 대비 Sirt1 억제제 처리군에서 증 식이 70 % 감소함을 확인하였다 (Figure 4A). Wound healing assay를 통해 Sirt1 억제제 EX527를 처리하여 세포의 이동성 을 확인한 결과 억제제를 처리한 군에서 이동성이 크게 감소 하는 것을 확인하였다 (Figure 4B). 또한 Sirt1 억제제 EX527 를 처리한 다른 구강암 세포주인 YD-8과 YD-15에서 MTT assay를 시행한 결과 농도 의존적으로 (0, 30, 50 μM) 세포의 증식을 유의성 있게 감소시켰다 (Figure 4C), 이들 결과는 Sirt1의 비정상적인 발현/활성이 구강암에서 증식과 이동성에 영향을 준다는 것을 보여주고 있다.

4. EX527 inhibits HOXC6-induced cell growth and proliferation

본 연구자의 이전 연구에서 HOXC6는 구강암에서 anti- apoptotic protein인 Bcl-2 발현을 조절하여 apoptosis를 억 제하였으며, HOXC6의 과발현은 세포 증식 marker인 Ki-67의 발현을 증가시킴을 보고하였다 [12-13]. 본 연구에서는 HOXC6 과발현된 FaDu 세포에 Sirt1의 억제제인 EX527을 처 리하여 HOXC6에 의한 세포증식에 Sirt1과의 연관성을 조사하 였다. 먼저, HOXC6를 FaDu 세포에 transfection 24 시간 후 Sirt1 억제제를 48 시간 처리하여 MTT assay를 통해 세포의 증식을 확인한 결과, control 대비 HOXC6 과발현 시킨 FaDu 세포에서 증식이 유의성 있게 증가한 반면, HOXC6 과발현 시킨 FaDu 세포에 Sirt1 억제제를 처리하였을 때 57 % 로 현 저하게 감소하였다 (Figure 5A). 또한 Cologenic assay를 통해 장기간 세포의 증식을 colony 형성을 통해 조사한 결과에서도 HOXC6의 과발현은 colony형성을 40 % 증가하였으나 Sirt1 억제제를 처리하였을 때 control 대비 20 % 정도로 유의성 있게 감소하였다 (Figure 5B). 이러한 결과를 바탕으로 FaDu 세포에서 Sirt1의 억제제에 의한 세포증식의 감소가 세포사에 의한 결과인지를 확인하기 위해 annexin V/PI staining을 통해 cell death를 확인하였다. Guava Muse Cell Analyzer를 이용 하여 확인한 결과 HOXC6의 과발현은 control 대비 세포사에 영향을 주지 않았으나, EX527를 함께 처리 시 24 시간과 48 시간에서 early apoptosis와 late apoptosis가 증가하였으며 24 시간에서 total apoptosis는 20 % 유도되었지만 48 시간에서 total apoptosis가 control 대비 50 %로 크게 증가하였다 (Figure 5C). 이들 결과는 EX527에 의한 세포증식 억제는 세포사에 의한 결과이며, HOXC6에 의한 조절기전에서 Sirt1와의 연관 성을 보여주고 있다.

5. Sirt1 Positively regulates HOXC6 Expression

이전 연구에서 전사인자들의 탈아세틸화는 Sirt1과 같은 sirtulins에 의해 매개되며, 이들의 발현 및 활성을 유도한다. 따 라서, Sirt1이 HOXC6의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 흥 미롭게도, FaDu 세포에 Sirt1 억제제 EX527 (5, 10, 20, and 50 μM)을 처리한 결과 HOXC6의 발현이 EX527 농도 의존적 으로 감소하는 것을 확인하였다 (Figure 6A). 또한 HOXC6의 transfection에 의한 HOXC6의 발현은 EX527과 함께 처리하였 을 때 HOXC6의 발현이 중요하게 감소하는 것을 확인하였다 (Figure 6B). 이들 결과는 HOXC6의 발현이 Sirt1에 의해 조절 될 수 있음을 나타내며, 이 결과를 바탕으로 Sirt1의 과발현을 통해 Sirt1이 HOXC6의 발현에 영향을 미치는지를 qRT-PCR과 western blot으로 확인한 결과 FaDu 세포에서 Sirt1의 과발현 은 HOXC6의 mRNA와 단백질의 발현을 모두 유의하게 증가 시키는 것을 확인하였다 (Figure 6C-D). 이러한 결과는 FaDu 세포에서 HOXC6에 의해 증가된 Sirt1이 HOXC6의 발현 또는 활성을 조절하고 있음을 보여주고 있다.

Ⅳ. DISCUSSION

이전 연구에서 우리는 HOXC6가 TCGA 및 GSE14333 database에서 정상 구강조직과 비교하여 구강암을 포함하는 두경 부암에서 유의성 있게 상향 조절된 유전자임을 확인했으며, 이는 HOXC6가 구강암에서 종양 유전자로 작용할 수 있음을 보여주고 있다 [19]. Homeobox family의 구성원으로 알려진 HOXC6는 척추동물 배아 발달에 관여할 뿐만 아니라 breast cancer, lung cancer, prostate cancer 그리고 leukemia과 같은 다양한 암에서 상향 조절되고 암의 형성 및 발달에 중요한 역 할을 한다 [20-23]. 그럼에도 불구하고, 구강암에서 HOXC6의 구체적인 역할은 알려지지 않았으며, HOXC6가 구강암에서 환자 생존 및 치료를 개선하기 위한 표적이 될 수 있는지 규명 이 필요하다. 현재, HOXC6는 발암 과정에서 많은 세포 신호 전달 경로의 중요한 조절자로 확인되었으며, 구강암 환자의 낮은 생존율과 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되고 있다 [24]. 이전 우리 연구에서 HOXC6는 구강 편평세포암종 (OSCC) 조직 및 세포주에서 과발현 되는 것으로 확인하였으 며, HOXC6이 Bcl-2 발현의 조절을 통해 anti-apoptosis 경로 및 항암제 내성에 중요한 조절자임을 발견하였다 [13-15]. 위 의 내용을 바탕으로 HOXC6는 다양한 암에서 발암에 중요한 역할을 할 수 있으며, 비정상적으로 조절되는 HOXC6 유전자 가 구강 발암 동안 형태발생적 및 대사 변화를 초래할 수 있음 을 추정해 볼 수 있다. 더욱이, HOX family 유전자들은 후생 유전학적으로 조절되며 DNA methylation 및 histone 변형을 통해 잠재적으로 정상 세포를 종양 표현형으로 유도할 수 있 는 가능성이 있다.

본 연구에서는 TIMER (Tumor Immune Estimation Resource) database 및 검증 데이터 세트에서 두경부암 환자에서 HOXC6 유전자 발현이 유의성 있게 증가하며, 생존율과 상관 관계가 있음을 확인하였다. 따라서 HOX6의 발현에 따른 differentially expressed gene (DEG) 분석을 RNA-seq analysis에 의해 확인하였으며, 생물정보학적 (biological processes and pathways) 분석은 HOXC6가 구강암 형성 과정에서 세포 대사 과정 및 경로에 관여할 수 있음을 시사하고 있다. 흥미롭게도, differentially expressed gene (DEG) 분석을 통해 보여준 새 로운 증거는 HOXC6의 발현세포에서 Sirt1의 발현이 중요하게 상향 조절됨을 확인하였고, 이들을 mRNA와 protein 발현을 통해 재확인하였다. Sirt1은 nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+)-dependent histone deacetylases로 Sirt1의 비정 상적인 발현은 구강암을 비롯한 다양한 사람 악성 암에 관여 하고 있음이 입증되고 있다 [24]. 그러나, 다양한 암에서의 Sirt1의 생물학적 역할은 폭넓게 연구되어 왔지만, Sirt1은 세 포 유형에 따라 암을 억제하거나 촉진하는 것으로 알려져 Sirt1의 생물학적 관련성은 상반된 결과들을 보이고 있다. Sirt1은 histone과 non-histone proteins의 deacetylation과 같 은 후생유전학적 조절을 통해 유전자 발현 조절에 중요한 역 할을 한다. Sirt1에 의한 histone의 deacetylation과 histone acetyltransferases (HATs)에 의한 histone acetylation간의 균 형은 정상적인 세포 기능에 매우 중요하며, 균형이 깨지면 암 형성에 관여하게 된다. 특히, Sirt1은 p53의 deacetylation 유 도하여 p53의 발현을 불활성화하여 p53에 의해 유도되는 세 포사멸을 억제하며, 마찬가지로, 세포 산화 스트레스 동안 Foxo3a의 Sirt1 매개 deacetylation은 세포 생존을 유도하는 것으로 보고되고 있다 [25-26]. 구강암에서 Sirt1의 E-cadherin 의 발현을 유도하여 침윤 및 전이를 억제한다고 알려졌으나 [27], 전립선암에서는 Sirt1의 E-cadherin의 전사 억제를 유도 하여 침윤 및 전이를 유발하는 것으로 보고되고 있다 [28]. 또 한, Sirt1은 구강암에서 TGF-β(transforming growth factor-beta) 매개 악성 형질전환, 침윤 및 전이를 억제하는 것으로 보고 되었다 [29]. 그와 반대로, Sirt1의 종양 억제 효과에 대한 보고 와 함께, 일부 연구에서는 종양유도에 관여하고 있음을 보여 주고 있다 [30-31]. 특히, Sirt1의 과발현은 annexin A4의 발현 을 증가시켜 구강암에서 항암제 cisplatin 내성을 유도하며 [32], Sirt1이 hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1α)과의 작용을 통해 종양 형성을 촉진한다는 것이 보고되고 있다 [33]. 이러한 결과는 구강암에서 Sirt1의 기능에 대해 논란의 여지가 있지만 직, 간접적으로 구강암 형성에 관여하고 있음 을 보여주고 있다. 따라서 앞으로의 연구는 이들 이슈를 명확 히 하고 새로운 치료법을 평가하기 위해서는 추가 연구를 진 행하고자 한다.

본 연구에서 HOXC6의 과발현은 Sirt1 유전자의 발현을 유 도함으로써 FaDu 세포에서 세포 증식 및 colony 형성을 증가 시켰으며, 동일한 조건에서 Sirt1 inhibitor EX527을 처리 시 HOXC6에 의한 세포 증식 및 colony 형성이 억제되었다. 또 한, EX527에 의한 세포 증식 및 colony 형성이 억제는 세포사 의 유도에 의한 결과임을 확인하였다. 이는 우리 연구가 HOXC6가 Sirt1과 함께 구강암 세포 증식을 유도시키는 동시 에 HOXC6 매개 Sirt1 신호 전달 경로 활성화를 유도함으로써 세포 사멸을 억제할 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 보여주 고 있다.

본 연구의 또다른 흥미로운 점은 Sirt1 inhibitor EX527을 처리 시 HOXC6의 발현이 억제되는 반면, Sirt1의 과발현이 HOXC6의 mRNA와 protein의 발현을 증가시켰다. 이들 결과 는 HOXC6에 의해 증가한 Sirt1이 HOXC6의 후생유전학적 변 화를 유도하여 구강암 형성 과정에 부분적으로 관여하고 있음 을 보여주고 있다 (Figure 6E). 이전 연구에서 구강암에서 비 정상적인 HOX 유전자의 발현이 조직 특이성 상실 또는 후생 유전학적 매개 기능 상실로 인한 것으로 나타나고 있고 [34], 특히, 구강암 표현형에 기여하는 종양 특성 및 요인을 결정하 는 HOX 유전자의 후생유전학적 조절 역할이 중요하다는 보 고를 통해 이들 내용을 뒷받침해주고 있다. 따라서, 구강암 치료의 새로운 치료 표적으로서 HOXC6와 Sirt1 신호전달기전 의 가능성과 HOXC6/Sirt1의 상호작용 및 정확한 메커니즘을 설명하기 위해 추가 연구가 필요하다.