Ⅰ. INTRODUCTION
조직을 구성하는 최소 단위에 해당되는 세포들은 이웃한 세포 또는 세포외 기질과 지속적으로 상호작용함으로써 세포 자체의 본질적 특징을 유지하고 세포 주위 환경에서 일어나는 변화에 적응한다. 세포의 이와 같은 상호작용은 다른 세포에 서 유리되는 다양한 물질을 수용하거나 세포외기질과 직접적 으로 접촉하는 과정을 통해 주로 일어난다1). 세포간 상호작 용 매개체 중 최근 주목받고 있는 것은 엑소좀으로 직경이 30-150 nm인 나노소포체(nanovesicle)이다. 엔도좀(endosome) 에서 유래한 막으로 구성된 소포체 형태로 내부에 mRNA, 비 유전자 암호화 RNAs(long non-coding RNAs, lncRNAs), DNA, microRNA(miRNA) 등의 다양한 유전체와 단백질을 함유하고 있다. 엑소좀은 이러한 유전체 또는 단백질을 전달함으로써 세포간 신호전달 수송체로서의 역할 뿐만 아니라 세포와 세포 외 환경 사이의 유전 물질 전달 매개체로서의 기능을 하는 것 으로 알려져 있다1,2). 엑소좀은 mRNA, miRNA 등을 패키징한 세포외소포체(extracellular vesicle) 형태로 분비되므로 내부 물질이 손상되지 않은 상태로 혈액을 통해 순환하면서 전신적 으로 퍼져 나가 다른 장기 또는 조직의 신호전달에도 영향을 미칠 수 있다. 주변 세포와의 상호작용과정에서 특히 종양세 포와 주위 미세환경 상호작용을 매개하는 과정에서 miRNA가 중요한 역할을 하는 것이 제시되고 있으며 엑소좀 내에서도 관찰되는 것으로 보고되고 있다1-3).
miRNA는 타겟 mRNA의 3′-비번역 부위(untranslated region, UTR)에 결합하여 해당 유전자의 전사후 발현을 억제하 는 기능을 가진 유전체로 약 18-25개 정도의 뉴클레오타이드 로 구성된 비암호화 RNA(non-coding RNA)이다. 암 발생 및 진행 과정이 암세포의 mRNA 전사 조절 뿐만 아니라 miRNA 발현에 의해서도 영향을 받는 것으로 보고되면서 암 진단 및 치료제 개발과 관련된 miRNA 연구도 늘어나고 있다4). 종양미 세환경내 다양한 세포들은 엑소좀에 둘러싸인 miRNA를 서로 주고받음으로써 영향을 전달할 수 있으며 이러한 과정을 통해 종양 진행 및 악성도 증가에 기여할 수 있을 것으로 추정된다.
구강암이 관찰되는 구강은 대표적인 만성염증질환이면서 매우 흔한 질환인 치주염이 발생하는 부위이기도 하다. 치주 염은 성인의 경우 특히, 나이가 많을수록 오랫동안 지속되는 치주염을 가지고 있었을 가능성이 높다5). 구강암 또한 나이가 많아질수록 발생 가능성이 높다는 공통점을 가지고 있어 구강 암 환자의 경우 치주염을 동시에 가지고 있는 경우가 많아 구 강점막 상피 세포와 종양 병소 부위는 치주염에서 유리되는 다양한 염증성 사이토카인에 영향을 받게 될 뿐만 아니라 지 속적으로 치주세균에 노출된다6-8). 그 결과 치주세균은 구강 암 세포 내로 침투하여 또는 종양 미세환경에서 구강암 세포 와의 상호작용을 유도하여 구강암세포의 생물학적 습성 (biologic behavior)이나 악성도에 영향을 미칠 것이라고 추정 할 수 있다. 대표적 치주염 병원균인 P. gingivalis는 구강암세 포 내로 침윤하며 세포내 감염 후 matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), MMP-9 와 같은 세포외기질 효소, interleukin-6 (IL-6), IL-8를 포함한 다양한 사이토카인 증가 등을 통해 구강 암세포의 침윤능과 전이능을 높인다는 연구결과들이 있다9,10). 이와 같이 치주염 환경이 구강암 세포에 영향을 미치는 과정 에서 엑소좀과 miRNA가 일정 역할을 할 것인지에 대한 분석 결과 요인과 역할 연구는 있으나 신호전달 매개체로 알려져 있는 엑소좀 및 엑소좀내 RNA에 대한 연구는 많지 않다. 본 연구에서는 치주세균이 감염된 구강암세포에서 유리되는 엑 소좀을 분리하여 엑소좀 내의 miRNA를 분석하여 구강암세포 와 주위 미세환경과의 상호작용 기전을 파악하고자 하였다.
Ⅱ. MATERIALS and METHODS
1. 구강암세포 배양
치은에서 기원한 구강편평세포암종 세포주 Ca9-22를 MEM/F-12(1:1)에 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, Hyclone Laboratories Inc., South Logan, UT, USA)이 첨가된 배지를 이용하여 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하며 유지하였다.
2. 치주세균 P. gingivalis 배양 및 P. gingivalis 감염
P. gingivalis strain 381을 GAM broth (5 μg/ml hemin, 2 mg/mL Vitamin K)(Nissui, Tokyo, Japan) 배지를 사용하여 37℃ 혐기성 배양기에서 배양하였다. 구강암 세포에 치주세 균을 감염시키기 위해 P. gingivalis를 감염다중도(multiplicity of infection, MOI) 100 비율로 구강암세포에 분주하여 3시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 구강암 세포내로 침투되지 않고 남아있는 P. gingivalis를 제거하기 위해 인산완충식염수 용액(phosphate-buffered saline, PBS) 으로 구강암 세포를 두 번 씻어 내었다. 항생제가 들어 있는 새 배지로 교환 후 이산화탄소 배양기에서 세포를 24시간 배 양하였다.
3. 엑소좀 분리
구강암 세포 배양 후 배지를 모은 후 세포와 세포 잔사들을 제거하기 위해 3,000 g 속도로 15분간 원심분리하여 상층액만 원심분리 필터 농축 컬럼(PALL)으로 옮겼다. 상층액 내에 있 던 엑소좀 외의 소포체를 제거하기 위해 3,000 g 속도로 40분 간 원심분리하고 이후 상층액만 10,000 g 속도로 다시 원심분 리하였다. 이후 상층액을 100,000 g 속도로 원심분리한 후 바 닥에 분리된 엑소좀을 100 μL PBS에 현탁하여 –80℃에서 보 관하였다.
4. miRNA 분리 및 분석
분리한 엑소좀에서 miRCURY exosome isolation kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 miRNA를 추출하였다. SMARTer smRNA-Seq kit(Clontech Laboratories Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 라이브러리를 구축하고 NGS 분석을 수행 하였다.
5. 통계 분석
성숙(maturation) miRNA reads를 계수하고 맵핑 된 결과의 총계에 대한 백만당 계수 (CPM)로 데이터를 표준화하였고, CPM값을 이용해 통계 분석을 수행하였다. 그룹 간 발현에 차 이를 보이는 miRNA의 정규화 및 계산은 R 프로그램의 edgeR 을 사용하여 수행되었다. |log2FC|>2와 p-value<0.05를 동시 에 만족할 때 그룹 간 유의미한 차이를 보인다고 판단하였다.
6. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) 경로 분석
유의미하게 변화된 miRNA의 표적 유전자와 관련된 주요 신호전달 경로를 확인하기 위해 miRPath v.3를 사용하여 KEGG 분석을 수행하였다. (https://dianalab.e-ce.uth.gr/htm l/mirpathv3/index.php?r= mirpath). 분석 시 miRNA의 표적 유전자 확인을 위해 TarBasev7.0과 Targetscan을 이용하였다.
Ⅲ. RESULTS
1. P. gingivalis에 감염된 구강암세포 배양 상층액에 포함된 엑소좀 유래 RNA-sequencing
치주세균 P. gingivalis에 감염되지 않은 구강암세포 배양액 에서 분리한 엑소좀을 대조군으로 하여 치주세균에 감염된 구강암세포에서 유리된 엑소좀 내 RNA를 분석하였다. 각각 의 RNA 발현 패턴은 세포에 따라 다소 차이를 보였으나 rRNA 비율이 50% 이상으로 주된 RNA 였으며 구성 비율은 치주세균 감염 여부에 의해 유의미한 변화를 보이지는 않았 다(Fig. 1). RNA 중 치주세균 감염에 의한 miRNA 프로파일 변화를 분석한 결과 상당한 수의 miRNA가 변화되었으며 그 중에서 logFC 절대값이 2 이상인 그리고 통계적으로 유의미 한 miRNA만을 추출하였다(Fig. 2).
2. Heatmap 분석 기반 엑소좀 유래 miRNA 프로파일링
치주세균 P. gingivalis에 의해 발현량 변화를 보인 엑소좀 miRNA 중 변화량 절대값(logFC)이 2이상 이면서 p값이 0.05 미만인 miRNA를 heatmap으로 표시하였다(Fig. 3). P. gingivalis에 의해 유의미하게 증가된 miRNA로는 miR-203-3p, miR-6516-3p, miR-483-59, miR-1275, miR-8485, miR-19a-3p 가 관찰되었다. 반면 치주세균에 감염된 세포에서 유리된 엑 소좀에서는 let-7a-3p, miR-106a-5p 등을 포함하여 14개의 miRNA가 뚜렷하게 감소되었다(Table 1).
3. 치주세균에 의해 변화된 miRNA 연관 KEGG 경로 분석
P. gingivalis에 감염된 세포에서 유래된 엑소좀이 주위 구강 암세포에 미치는 영향, 종양 미세환경내에서의 역할과 작용 기전을 파악하기 위해 Tarbase 및 Targetscan 프로그램을 활 용하여 치주세균 감염 세포에서 유의미하게 증가 또는 감소한 miRNA 관련 경로를 분석하였다. 프로그램에 따라 차이가 있 어 Tarbase 프로그램의 경우 지방산대사(fatty acid metabolism), Hippo 신호전달 경로, 부착접합(adherens junction) 경 로 관련성을, Targetscan의 경우 글리칸 분해(glycan degradation) 경로와의 연계성을 보였다 Fig. 4). 이러한 차이에도 불 구하고 치주세균에 의해 감소된 miRNA의 경우 ECM-receptor interaction 경로는 공통적으로 관찰되어 치주세균이 암세포 침윤 및 전이 과정에 중요한 세포외기질과의 상호작용에 영향 을 미침을 추정할 수 있다. 치주세균에 의해 증가된 miRNA는 p53 신호전달 경로, 갭 접합(gap junction)과의 연관성을 보였 다(Fig. 5).
Ⅳ. DISCUSSION
엑소좀은 내부에 mRNA 외에도 miRNA, piRNA, circular RNA 등의 비암호화 RNA와 같은 내용물을 함유한 상태로 이 동하여 표적세포에 전달하는 과정을 통해 구강암 발생, 증 식, 전이 등에 관여한다고 알려져 있다11). 이러한 특징은 구 강암을 진단하기 위한 표지자 개발뿐만 아니라 구강암 치료 제 개발을 위한 표적 발굴에도 활용될 수 있으므로 엑소좀 내부 물질에 대한 상세한 분석을 포함한 구강암 관련 엑소좀 에 대한 광범위한 연구가 필요하다. 이와 같은 개념에 기반 하여 He L 등은 구강암 환자의 타액 엑소좀에서 miR-24-3p 가 증가하는 것을 확인하고 구강암 진단의 표지자로 제시하 였다12). 한편, Sun LP 등과 Li YY 등은 각각 암연관 섬유모 세포(carcinoma-associated fibroblast)에서 분비된 엑소좀이 miR-382-5p와 miR-34a-5p를 통해 주변 암세포의 증식과 침 윤을 촉진하는 것을 관찰함으로써 구강암세포와 종양 주위 미세환경 상호작용에서 엑소좀의 역할을 보고하였다13,14). 본 연구에서도 종양 주위환경에 존재하는 치주세균에 노출시 구강암세포에서 분비되는 엑소좀 miRNA 변화가 관찰되었으 며 이는 치주세균 자극이 엑소좀을 이용하여 이웃한 구강암 세포에 작용함으로써 침윤 등의 생물학적 습성에 영향을 미 칠 수 있음을 의미한다. 한편 구강암 조직 내 miRNA를 조사 한 연구에서 양성조직에 비해 9개의 miRNA(hsa-miR-19a; hsa-miR-512-3p; hsa-miR-27b; hsa-miR-20a; hsa-miR-28-3p; hsa-miR-200c; hsa-miR-151-3p; hsa-miR-223; hsa-miR-20b) 가 증가되어 있었고 7개의 miRNA(hsa-miR-22; hsa-miR-516-3p; hsa-miR-370; hsa-miR-139-5p; hsa-let-7e; hsa-miR-145-3p; hsa-miR-30c) 감소되어 있다고 보고되었다15). 발현변화를 보인 miRNA가 엑소좀에서 기원한 것은 아니지만 이 중 miR-19는 흥미롭게도 치주세균에 감염된 구강암세포 유래 엑소좀에서 도 증가되어 있었다. Christopher AF가 miR-19a/b는 SOCS3 를 표적으로 하여 구강편평세포암종에서의 염증반응을 조 절하며 이는 염증-구강암 상관관계를 연결하는 중요한 요소 임을 제안한 점을 고려시 치주세균은 miR-19a를 통해 구 강암세포 생물학적 습성 변화를 유도할 것이라고 추정할 수 있다16).
발현 변화를 보인 miRNA가 관여하는 신호전달 경로는 분 석 프로그램에 따라 차이를 보였으나 Targetscan 활용 분석시 증가된 miRNA는 gap junction 이나 세포부착 상호작용 경로 와 관련되어 있었다. 세포의 침윤능 증가에 기여하는 일차적 인 기전 중 하나가 세포부착 변화임을 고려시 해당 경로 연계 성은 시사하는 바가 크다. 또한, 엑소좀에서 감소되어 관찰되 는 miRNA 관련 경로 중 두 가지 분석 방법 모두에서 세포외기 질-수용기 상호작용(ECM-receptor interaction) 경로가 관찰되 었다. 최근 Guo 등은 구강암 환자의 혈청 엑소좀에서 분리한 단백질을 기반으로 한 KEGG 경로 분석 결과에서 ECM-receptor interaction 관련성을 제시하였다17). ECM-receptor interaction은 세포 침윤능 뿐만 아니라 다양한 세포내 신호전달 경로 활성화 등 세포 악성도 증가를 포함한 생물학적 습성 변 화 유도에 중요한 반응 중의 하나이다. 치주세균 자극시 관찰 되는 ECM-receptor interaction 경로 관련 miRNA 발현 변화는 구강암 세포의 침윤능 증가와의 연관성을 제시해주는 것으로 이는 종양주위미세환경내 치주세균은 구강암 세포의 악성도 증가에 기여함을 의미한다. 종양내 세균과 종양간의 상호작용 은 Helicobacter pylori 세균과 위암 발생사이의 연관성을 예로 들며 세균이 암발생 과정에서 일정 역할을 한다고는 추정하고 있지만 지속적 염증 자극 등의 소인 외에 기전을 보여주는 직 접적인 증거는 거의 없는 상태이다. 본 연구를 통해 주위 치주 세균에 감염된 구강암세포의 경우 유리되는 엑소좀내 miRNA 발현 변화가 종양세포와 주위 환경과의 연결하는 중요 기전 중의 하나임을 의미한다. 한편, Zhao와 Hu는 세균이 대사 활 성이 있는 상태로 종양세포 및 면역세포의 세포질 내에 주로 위치하고 있다는 Nejmen 등의 연구를 언급하면서 세포내 세 균이 종양세포의 생물학적 과정에 영향을 미치므로 종양 미생 물에 대한 조절 즉, 미생물-표적 치료 개발의 필요성을 제안하 였다18,19). 본 연구에서는 P. gingivalis의 Ca9-22 세포내에서의 생존 및 대사 활성 유무를 확인하지는 않았으나 엑소좀 miRNA 발현 변화를 고려시 P. gingivalis가 Ca9-22 구강암 세포내 유전자 조절에 직접적으로 기여함을 확인할 수 있었 으며 이러한 소견들은 구강암 제어 및 항암제 저항성이 높은 구강암 치료제 개발에 필요한 방향성을 제시하는 것으로 판단 된다.
