Ⅰ. INTRODUCTION
질병관리본부 국립중앙인체자원은행 운영·관리 규정 제2 조 제1호에 따르면 인체자원이란, 인체유래물과 그에 관련된 임상·역학정보를 포괄적으로 지칭하는 용어이다1). 인체자원 을 수집·보관하는 기관을 인체자원은행 또는 인체유래물은 행(biobank)이라고 한다. 이때 인체자원은행은 생명윤리 및 안전에 관한 법률 제2조 제13호와 제41조 제1호에 따라 보건 복지부장관에게 개설 허가 및 관리를 받고 타인에게 자원을 분양할 수 있다2). 한국인체자원은행 사업 (Korea Biobank Project, KBP)의 제1~3기 사업에 참여한 국립중앙인체자원은 행과 17개의 민간 인체자원단위은행을 비롯하여 국내에는 2017년 기준으로 69개의 인체유래물은행들이 있다3). 2021년 3월부터 시작한 KBP 제4기 사업에는 더 확대된 규모인 10개 의 거점은행들 및 24개의 협력은행들이 참여한다4). 2021년 기 준, 보건복지부장관에게 개설 허가를 받은 치과병원 기반 인 체자원은행은 총 4군데(부산대학교 치과병원, 사과나무치과 병원, 서울대학교 치과병원, 연세대학교 치과병원, 가나다순) 이다. KBP 제1~3기 사업에 참여한 치과병원 기반 인체자원은 행은 없었으나 제4기 사업에는 서울대학교 치과병원을 거점 은행으로 하여 사과나무치과병원과 연세대학교 치과병원까지 포함한 최초의 치과병원 기반의 인체구강유래물자원은행(이 하 구강자원은행) 네트워크가 구성되었다. 이번 문헌 고찰에 서는 치과병원 기반의 인체자원은행에서 주로 다루는 구강유 래특수자원인 치아, 치태, 치은 열구액 및 타액을 중심으로 구강유래자원의 수집과 활용에 대해 논의하려 한다. 아울러 구강유래자원의 뱅킹에서의 치과병원 기반 인체자원은행의 역할에 대해 확인하려 한다.
1. 구강유래특수자원의 특성과 활용
1) 치아, 치아주위조직 및 치아 가공 이차자원
치아는 법랑질, 상아질, 백악질과 같은 경조직과 신경혈관 조직이 풍부한 결합조직성 치수로 구성되어 있다5). 치아에는 포함되어 있지 않지만 치아와 둘러싸는 치조골을 연결하는 치 주인대가 있으며 치아 발치 시 치근에 부착된 채로 딸려 나오기 도 한다. 발치된 치아는 성장기에 자연 탈락하는 유치와 질병 또는 교정 치료 목적으로 발치되는 영구치가 있다. 일반적으로 치아우식증, 외상, 흡수가 동반된 치아는 발치 시 이미 손상이 되어 있으나 치주질환에 의해 동요도가 있는 치아 및 교정 치료 를 위한 소구치 발치는 건전한 치질의 치아를 확보할 수 있다. 치아는 크기나 구조적인 기형을 동반할 수 있어 수집 시 관련 정보가 구체적으로 기록되어야 한다6,7). 건전 치수 조직을 얻기 위해서는 치수염이나 신경치료를 한 치아를 피해야한다.
치아의 경조직은 재료 연구, 환경 역학 연구, 진단 연구 및 재생 연구 등에 쓰일 수 있다. 치아의 경조직은 골소실 부위의 이식재와 같은 치과생체재료로서 가능성이 있는 동시에 수복 재료와 접착제 등 치과생체재료를 연구하기 위한 플랫폼으로 쓰이기도 한다8-12). 일정한 시기에 탈락하는 유치는 태아 및 소아 생애주기 내 화학물질, 중금속 및 환경 유해 물질 노출을 추정할 수 있어 역학 연구에 활용된다13-16).
치아는 인체에서 유일하게 체외로 노출된 경조직이다. 구강 내로 완전히 노출된 치관부와 치은열구를 사이에 두고 치은으 로 한층 덮여 있는 치관부는 다양한 혐기성 세균들이 상주하는 경조직 생물막(biofilm)을 이루어 특징적인 마이크로바이옴을 구성한다17,18). 개인의 구강 위생 및 치주 건강 상태와 관련된 치태 침착 그리고 치은 열구액 분비는 그 자체로 치아와 주위 조직의 마이크로바이옴에 영향을 주기도 하고 연구자들이 마 이크로바이옴을 확인할 수 있는 매개체이기도 하다18-21). 치태 와 치은 열구액은 타액에 비해 발생하는 상대적인 검체 양이 적으나 마이크로바이옴의 부위별 특이성을 비침습적으로 확 인할 수 있다는 장점이 있다. 한 개인에서도 치아 간의 치주질 환 이환 및 골 소실 정도에 따라 마이크로바이옴 분포에 차이 가 있을 수 있고 치은연상 및 치은연하 마이크로바이옴의 구성 도 상이하다22-25). 따라서 마이크로바이옴 연구를 위한 검체 수집 시에는 치식을 비롯한 검체의 구체적인 채취 부위와 방법 을 상세하게 기록하여 연구자들이 분양 시 참고할 수 있도록 해야 한다. 이외 치은 열구액은 치주질환 진단과 바이오마커 연구에 활발히 활용되고 있다19-21,26,27). 치주질환과 심혈관질 환, 당뇨, 폐렴, 종양, 치매 등 다양한 전신질환이 연관성이 있다는 연구 결과들이 활발히 생성되고 있는 만큼 치태와 치은 열구액 검체는 구강질환뿐만 아니라 전신질환의 병인을 밝히 거나 진단법을 찾는데 기여할 것으로 기대된다28-31).
중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 치아 및 치아주위조직에서 가공할 수 있는 대표적인 이차자원으로 많은 치아 전문 인체자원은행에서 MSCs의 배양을 중요 자원 으로 내세우고 있다32-34). MSCs는 성체의 기질 조직에서 분리한 줄기세포로 골세포, 연골세포, 지방세포 및 근육세포 등 다양 한 결합조직 세포로 분화할 수 있는 다분화능(multipotent) 세 포들이다35). MSCs는 치수, 치낭, 치주인대, 치근유두, 치은 및 골수에 있다36,37)(Fig. 1). MSCs는 기존 진료 외 추가 술식 없 이 자연 탈락한 유치, 질병이나 교정치료를 위해 발치한 영구 치 및 동반된 치은 조직에서 분리할 수 있다38,39). 염증이나 괴사가 동반된 치수나 치은 조직에서도 MSCs를 분리할 수 있 으나 비염증성 조직에서 획득한 MSCs와 다른 생물학적 특성 을 보일 수 있다40-43). MSCs는 치아, 치주인대 및 치수 재생과 같은 치의학 영역의 연구뿐만 아니라 상처 치유, 연조직 및 골 재생, 면역조절 연구 등에 광범위하게 쓰인다44-49).
2) 타액, 협점막 도말 및 구강 린스
두경부 영역에는 3개의 대타액선(이하선, 악하선, 설하선) 과 무수한 소타액선들이 있다. 소타액선은 경구개 전방부와 부착 치은을 제외한 구강에 전반적으로 분포하고, 비강, 부비 동, 인후두, 기도 및 폐 점막 하방에도 위치한다50). 타액선에 서 발생하는 타액은 저작과 같은 자극에 의해 발생하는 자극 성 타액과 구강 움직임이 없는 상태에서 발생하는 비자극성 타액으로 구분된다51). 자극성과 비자극성 타액은 시간당 발생 량, 점도, 단백질, 호르몬 및 미생물에 차이가 있다52-56). 타액 은 대부분 물이며 뮤신, 이온, 효소 및 항균 성분으로 구성되 어 있다57). 칼슘, 아밀레이즈, 뮤신 및 타액 단백질들의 비율 은 연령에 따라 차이가 있을 수 있다58-62). 일반적으로 채취한 타액에는 타액 뿐만 아니라 치은 열구액, 탈락한 상피세포, 잔여 음식 성분, 백혈구, 미생물 및 체내 화합물 성분들이 포 함되어있다53).
타액 내 성분들은 대체로 혈청에 비해 농도가 낮다고 알려 져 있지만 진단 기술의 민감도 향상으로 타액에서 호르몬, 항 체, 효소, 사이토카인, 성장인자, 체내 약물, 세균 및 바이러스 등을 효과적으로 검출하여 진단 목적으로 사용할 수 있다 63-68). 타액에서는 미생물의 유전정보(DNA, RNA) 말고도 인체 의 유전정보를 포함하고 있다67). 이런 요소들을 통해 치아 우 식증, 치주염, 구강암과 같은 구강 질환 및 타액선에서 발생한 타액선종양, 쇼그렌 신드롬이 외에도 심혈관 질환, 당뇨, 신장 질환, 신경정신질환, 낭포성 섬유증, 다른 장기의 종양, 인간 면역결핍 바이러스, 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 독감 바이러스 등 전신 질환의 진단에 활용할 수 있다는 연구 결과 들이 나오고 있다67,69-72).
협점막 도말 및 구강 린스 검체에서 대상자의 DNA를 간편 하게 추출할 수 있으나 함유된 RNA 및 단백질의 양이 적어 추출에 어려움이 있을 수 있다73-75). 최근 협점막 도말과 구강 린스는 구강 마이크로바이옴 수집에 흔하게 활용되고 있다 76-79). 특히 구강 린스는 구강 마이크로바이옴의 전반적인 양 상을 대표하는 검체를 얻는데 타액보다 우수하다고 한다79,80).
2. 구강유래자원의 수집 및 보관
두경부 영역에서는 일반적인 연조직 검체 외 구강유래특수 자원인 치아, 치태, 치은 열구액 및 타액을 확보할 수 있다. 치과병원에 기반한 인체자원은행들의 수집 자원 현황에 대한 공식적인 보고는 아직 없지만 치과 검체들의 특성을 고려하였 을 때 혈액 자원 위주의 국립중앙인체은행과 종양성 질환의 혈액과 연조직 검체가 대표 자원인 KBP 인체자원단위은행들 과 달리81) 치과병원 기반의 인체자원은행들은 치주질환, 구강 점막질환, 골수염, 타액선염 등 염증 질환을 바탕으로 한 구강 유래특수자원을 위주로 구성될 것을 예상할 수 있다. 특히 치 아, 치태 및 치은 열구액은 채취를 위해 전문적인 기술을 요하 며 보통 치과의사들에 의해 수집 가능하다. 검체의 수집, 보관 및 질 관리가 잘 정립되어 있는 일반 연조직이나 혈액 검체에 비해 구강유래특수자원에 대한 수집 및 관리 지침은 아직 논 의 단계에 있다. 일반 연조직 검체에 견주어 마련된 관리 지침 들이 있지만 검체 내 상세 유전정보, 단백질 및 기타 화합물들 을 기준으로 장기간 추적하며 분석한 결과들이 부족하다. 이 중 치태와 치은 열구액의 관리에 대한 보고는 매우 부족한 실 정이며 인체자원은행 주축의 연구들이 필요하다. 구강유래자 원의 수집 기준은 기관별로 상이하여 대규모 연구 코호트를 구축하는데 어려움이 있다. 표준화 대상은 채취 술식 뿐만 아 니라 구체적인 채취 위치, 양, 시간, 환자의 구강 및 전신 상태, 습관 조절 등이 포함된다. 구강유래특수자원의 수집과 보관에 대한 표준화된 규약을 마련하는 것은 치과병원 기반의 인체자 원은행들이 당면한 중요 과제이다.
1) 치아 및 치아유래 줄기세포
발치 한 치아를 운송할 때에는 phosphate buffered saline( PBS)이나 Hanks buffered saline solution(HBSS)와 같은 평형 염액(balanced salt solution), 혹은 상용화 제품 (HypoThermosol®, MesenCult™ basal medium)들인 보존 용 액에 담아야 한다34,82,83). PBS는 비용이 더 비싼 상용화 운반 용액과 보존 정도에 차이가 없어 실용적이다83). 치아의 세포 는 4℃ PBS에 운반하였을 때 최대 120 시간 이내 배양이 가능 하다고 보고 되어 있지만 대부분의 문헌에서는 치아 발치 후 40~48 시간 이내에 조직 처리 할 것을 권장한다34,83,84). 세포 추출이 필요한 치아는 멸균된 식염수로 세척한 후 polyvinylpyrrolidone- Iodine(PVP-I) 및 sodium thiosulfate 등으로 살균 처리한 다음 치수강에서 치수 조직을 추출, 조직 분해, 세포 분리, 배양을 통해 중간엽 줄기세포를 얻는다. 추출한 MSCs 및 별다른 가공을 하지 않은 치아 자체는 저온 (-80℃ 혹은 -170℃ 이하)에서 보관한다. 이때 얼음 결정 발생에 의한 세포막 손상을 방지하기 위하여 10% dimethyl sulfoxide, ethylene glycol, propylene glycol와 같은 동결보호제를 사용하 기도 하며84), 자기장을 이용한 냉동 법 등을 사용하여 손상을 최소화하기도 한다82,85).
지난 연구에 따르면, 동결 보존된 치아에서 추출한 MSCs가 세포 줄기성(stemness)을 유지할 수 있으며 적절한 배지에서 는 다분화능이 보존된다고 한다84). 이런 조건에서 치주인대 조직도 세포의 활성을 유지할 수 있으며, 표면 단백질들이나 효소들의 특성도 유지된다고 한다85,86). 동결 보존 치아와 유 래 MSCs의 생물학적 및 물리적 성질의 변화에 대한 장기간 추적 연구는 부족하지만 2년 간의 동결 보존되었던 MSCs가 활성을 유지하고 조골세포로 분화하여, 치아 및 유래 MSCs의 장기간 보존의 가능성을 시사하기도 했다87). 동결 보존된 치 아는 동결 보존하지 않은 치아에 비해 강도는 큰 차이가 없지 만, 수직 치아 파절의 부작용을 보여 이에 대한 추가적인 평가 가 필요하다86). 연구 목적에 따른 치아 자체의 보관 관리에 대한 연구 결과들은 거의 없으며 향후 연구 수요에 맞추어 분 석해볼 필요가 있다.
2) 타액, 협점막 도말 및 구강 린스
타액은 혈액이나 조직에 비해 비침습적 채취가 가능하며 환자가 직접 할 수 있을 정도로 절차가 간단하고 혈액과 달리 응고를 방지하기 위한 절차가 필요 없다64,69). 이런 장점들에 도 불구하고 타액은 일주기, 식사, 껌 저작 여부, 월경주기, 항콜린제, 항우울제, 항이뇨제와 같은 약물 복용, 양치, 가글 등의 요소에 영향을 받으므로 검체 채취 시 이에 대한 고려와 통제가 필요하다57,88-90). 타액선 기능을 떨어뜨리는 약물이나 두경부종양으로 방사선 치료를 받은 환자, 쇼그렌 신드롬 환 자, 감염 및 타석으로 인한 타액선염이 있는 환자는 타액선 기능 저하로 인해 타액의 충분한 확보가 어려울 수 있다51,91).
타액, 협점막 도말 및 구강 린스는 채취 직전의 음식물 섭 취, 물 이외 음료 섭취, 껌 씹기, 흡연, 양치, 구강세척액의 사용 등에 영향을 받을 수 있으므로 검사 30분 전부터 이를 자제해야 한다68). 타액은 흘리기, 뱉기, 스펀지 흡수 및 석션 으로 모을 수 있다68). 뱉어서 모은 타액은 구강 내에서 떨어진 미생물까지 해서 더 풍부한 마이크로바이옴이 포함될 수 있으 므로 타액 수집 시에는 채취 방법을 통일할 필요가 있다92).
타액은 멸균된 채취용 튜브 혹은 상용화된 키트에 담으며, 그 양은 키트 마다 다르지만 대략 1.0-2.5mL 정도이다. 타액 을 채취용 튜브에 모을 때는 대략 5분을 연속으로 모으는 것 이 권장된다93). 이때 자극은 타액선 분비에 영향을 줄 수 있으 므로 대상자는 움직임을 최소화해야 한다.
채취된 타액은 2-8℃에서 단기간 보관이 가능하며 최대 48 시간 이내에는 분리 정제를 해야 한다68,73,94). 키트에 따라 동 결 보존 전 검체의 보관 방식이 상이하며, 이동 중에는 4℃를 유지해야한다. 임시 냉장 보관은 미생물 증식을 억제하고 효 소 활성으로 인한 타액 단백질의 분해를 저해한다,68). 타액 성 분에 따라 분해 속도는 달라 IgG와 프로게스테론은 상온에서 각각 일주일 및 세달 간 보관을 해도 농도에 변화가 없는 반면 에 카테콜아민은 매우 짧은 생물학적 반감기로 인해 급격하게 분해된다95-97). 부적절한 온도에서 임시 보관된 타액은 보관된 시간이 길어질수록 왜곡된 성분 비율을 보이게 된다.
타액 채취 후 세포 용해 및 원심분리 처리 과정을 통해 원하 는 연구 표적을 분리한 후 동결 보존한다. 동결 보존된 타액은 5년이 지난 후에도 단백질 및 유전 정보가 유지된다는 결과가 있어 타액의 장기간 저장 가능성이 예측되나 이는 개별 단백 질, 호르몬, 마이크로바이옴 및 유전 정보에 따라 상이할 수 있으므로 추가 연구가 필요하다98). 인체자원은행들은 타액 자 원의 수요를 예측하여 타액 검체를 분리 보관하고 질 관리 계 획을 세워야 한다.
협점막 도말은 멸균된 면봉으로 양쪽 협점막을 30-45초 정 도 문질러 채취한다. 이를 멸균된 튜브에 담아 4℃를 유지한 채로 48시간 이내에 이송되어 DNA 추출을 해야한다73,99). 구 강 린스는 0.9% 생리식염수, PBS 또는 알코올 성분의 가글액 을 45-60초 간 머금고 있다가 뱉어서 채취하며, 마찬가지로 4℃를 유지한 채로 48시간 이내에 이송하여 DNA 추출을 해야 한다74,75,99). 알코올 성분의 가글액은 마이크로바이옴에 영향 을 줄 수 있어 미생물 연구 사용에는 부적절하다.
3) 구강 마이크로바이옴
마이크로바이옴은 인체 내부 및 표면에 서식하는 세균, 바 이러스, 진균, 원생동물과 같은 미생물들의 집단과 이들의 유 전 물질을 의미한다100). 마이크로바이옴은 인체 검체를 직접 분석하거나 미생물을 검체에서 분리 배양하여 연구할 수 있다 101,102). 현재의 기술로는 미생물 종류의 90% 이상을 연구실 환경에서 배양할 수 없어 배양 조건에 살아남는 미생물만 배 양할 수 있다103). 특히 혐기성 세균은 혐기성 환경을 생성할 수 있는 워크스테이션 장비 등을 이용해야 한다104). 오믹스 기술의 발전으로 단편적인 시간을 구성하는 마이크로바이옴 의 분석은 용이하나, 시간 및 공간에 따라 역동적으로 변하는 마이크로바이옴의 양상을 온전히 분석하는 것은 한계가 있다 105,106). 그러므로 마이크로바이옴 연구를 위한 자원의 수집은 채취 조건의 설정과 통제가 결정적인 요소이다106). 항생제나 스테로이드제와 같이 구강 마이크로바이옴을 변화시킬 수 있 는 약물의 사용은 충분한 휴지기를 가져야 하나 상세 조건은 추가 연구가 필요하다.
마이크로바이옴의 채취 시 미생물 계를 유지 반영할 수 있 는 완전 표본(intact sample)을 얻어야 한다. 구강은 세부적인 해부학적 위치에 서식하는 마이크로바이옴의 조성 및 구조가 다르므로107) 연구 목적에 맞춰 채취할 검체의 위치를 명확히 설정하고 채취 방식을 결정해야 한다. 이는 인체자원은행이 단독으로 결정하기는 어려우며 마이크로바이옴 연구를 하는 연구자들과 꾸준한 교류를 통해 조절해야 한다. 구강 마이크 로바이옴은 타액에 부유 미생물, 치아, 치태 및 점막 표면의 부착 미생물로 나눌 수 있다108). 부유 미생물은 타액이나 구강 린스를 통해 수집할 수 있고 부착 미생물은 점막 표면 도말이 나 치태 채취로 얻을 수 있다.
마이크로바이옴은 -80℃에서 장기간 동결 보존이 가능하며 유전 정보가 비교적 온전하게 유지된다고 한다100,109). 미생물 계통에 따라 유지가 되는 기간은 다를 수 있으므로 이에 대한 주기적 분석이 필요하다. 유전체는 상온에서 24시간 내 분석 가능하지만 전사체와 대사체는 분자 안정성이 떨어지므로 4℃에서 수송 후 최대한 빨리 분석해야 한다. 혐기성 세균은 열린 공간에서 산소가 노출이 되면 운반 도중에 사멸하므로 혐기성 환경을 유지한 용액과 전용 용기에 운반할 것을 권장 한다108,109).
3. 인체자원은행 내 고품질 자원의 생성을 위한 고려사항
대다수의 질환 중심형 인체자원은행들은 병리 검사 후 남 은 검체 위주의 수집을 하다보니 수집에 비해 분양이 못 미친 다는 문제가 대두되었다110). 미국의 456개 인체자원은행 관리 자들을 상대로 설문조사를 한 결과, 약 70%가 수집 자원이 잘 활용되지 않고 있다고 대답하였다111). 자원의 활용이 떨어 지는 원인으로는 연구 수요가 거의 없는 검체를 무작정 수집 하는 행위, 연구자 기대에 못 미치는 검체 질 관리와 임상 정 보의 연계, 검체 수집과 관리에 대한 표준화 지침의 부족, 분 양 정보의 부족과 절차의 어려움 등이 있다.
이러한 문제를 타계하기 위해 인체자원은행들은 ‘남은 검 체’들을 최대한 확보하던 것에서 연구자 수요를 충족 시킬 수 있는 고품질 자원의 확보로 패러다임을 옮기고 있다. 이는 기 존의 연령과 성별 정보뿐만 아니라 질환 맞춤형 임상, 역학, 영상 및 병리 정보의 확보를 통해 얻을 수 있다. 또 환자 별로 조직 검체와 짝지어 수집한 체액 및 마이크로바이옴 검체를 마련하는 다중 자원의 수집, 환자의 진료 진행에 따른 장기 추적 및 자원 수집, 전신질환 정보 및 건강한 대조군 검체의 확보를 통해 지원할 수 있다. 체액이나 마이크로바이옴은 하 루 중 채취 시기나 방식, 구강위생 행위, 약물 복용 여부, 식습 관 등에 영향을 받으므로99,112-114) 수집 조건에 대한 상세 정보 의 기록을 통해 자원의 질을 높일 수 있다. 이러한 정보는 인 체자원은행 단독의 노력으로 도달하기는 어려우며 자원을 기 증하는 임상의들과 및 분양 받을 연구자들과의 꾸준한 소통 및 협력 체계로 달성할 수 있다.
대다수의 구강 질환과 같이 검체가 희귀 할수록 연구에 필 요한 적절한 수의 검체를 단독 기관에서 분양 받기 어려울 수 있다. 인체자원은행 별로 자원 수집 및 보관에 대한 규약이 다를 경우, 이들을 통해 분양 받은 자원들을 동일한 연구에 적용하기 어려울 수 있다. 구강질환이나 구강유래자원과 같은 특수 자원을 전문으로 하는 인체자원은행들은 네트워크 결성 및 운영 표준화로 연구자들에게 대규모 자원 코호트를 제공할 수 있다. 이런 일련의 노력들로 질환 중심형 인체자원은행들 은 자원의 활용도를 높이고 인체유래물 연구를 진행하는 연구 수요자들에게 맞춤형 지원을 할 수 있다.
Ⅱ. CONCLUSION
구강질환 검체나 구강유래자원을 전문으로 하는 인체자원 은행의 부족으로 연구자들은 치의학 분야의 인체유래물 연구 를 하는데 어려움이 많았다. 치과병원 기반의 인체자원은행들 은 이제 태동기 단계로 연구자들에게 맞춤형 연구 지원을 하 기 위해서는 체계적이고 표준화된 자원의 수집과 보관을 할 필요가 있다. 이를 이루기 위해서는 인체자원은행과 더불어 기증을 해주는 임상의들과 실질적 중개 연구를 진행하는 연구 자들과 협력이 체계가 중요하다. 치과병원 기반의 인체자원은 행들의 적극적인 활동으로 중개 치의학 연구의 활성화가 기대 된다.