Ⅰ. INTRODUCTION
평균수명이 길어지고, 인구의 고령화에 따라 나타날 수 있 는 여러 가지 질병 중 골다공증은 흔히 나타나는 노화로 인한 질병 중 하나이다. 골다공증이란, 골밀도의 감소로 골절이 높 아진 질환을 말한다. 골다공증의 경우 처음에는 그 질병을 인 지하지 못하나, 골절이 발생하여 뼈를 검사하는 경우를 통하 여 확진을 받는다. 건강보험심사평가원의 통계에 따르면, 골 다공증 환자의 수는 2017년 906,631명에서 2018년 972,196명 으로 1년 사이에 환자 수가 일 년 사이에 7.2% 정도 증가 한 것을 알 수 있다. 골다공증 발병이후에는 추가적인 다른 질병 들이 나타나므로, 그 예방이 매우 중요하다. 특히 여성의 경우 에스트로겐 생산이 급격히 감소하는 폐경기 이후에는 골모세 포의 골형성 기능저하 및 파골세포의 계속적인 골 흡수활동에 의한 골 손실율이 1년에 2~3%씩 증가하는 것으로 알려져 있 어 특히 예방의 중요성이 강조된다. 골발생, 골성장 및 형성된 골의 유지에는 호르몬, 비타민 등 많은 요인들이 작용하므로 골대사의 작용기전을 밝혀내기가 어렵다. 뿐만 아니라 골다공 증의 주요치료제는 비스포스포네이트 계열, 선택적 에스트로 겐 수용체 조절제(SERMs)계열, RANKL 단클론항체, 부갑상선 호르몬 계열을 사용하고 있으며 골흡수를 하는 파골세포의 활 성을 억제함으로써 예방 및 치료를 하고 있다. 이들 약물들은 오랜 기간 동안 복용하여야 하며 턱뼈괴사, 대퇴골골절, 자궁 출혈, 유방암등의 많은 부작용이 나타낸다. 따라서 골다공증 의 완벽한 치료를 위해서 파골세포의 활성을 억제할 뿐만 아 니라 조골세포의 활성을 촉진시켜 골형성을 증가시키는 것이 중요하며 부작용이 적고 오랜 기간 동안 복용할 수 있는 천연 물을 이용한 안전한 약물개발이 필요하다.
예로부터 관절질환을 치료하고 회복하는데 홍화씨, 우슬, 마 가목 등을 주로 사용하였다. 홍화씨는 국화과에 속하는 홍화 (Carthamus tinctorius)의 씨앗으로 골절 및 골다공증 등의 골질 환에 뛰어난 효과가 있는 것으로1) 알려져 현재 국내에서 민간 요법으로 환이나 가루, 기름등의 형태로 가공되어 사용되고 있 다. 홍화씨의 효능에 대한 과학적인 근거 및 치료효과를 확립 하기 위하여일련의 연구들이 활발하게 진행되어 Song2)등은 홍 화씨에서 생리활성물질인 lignan, flavonoid 및 serotoin 성분 들을 분리하여 구조식을 밝혔다. 그 외 Kutsuna3)등은 홍화씨 의 리놀레산을 이용한 혈중 콜레스테롤 감소로 혈류를 개선하 고 동맥경화와 고혈압 예방, 노화방지 등 여러 가지 효과를 보 고하는 등 다양한 연구가 이루어져왔다.
홍화씨의 골질환과 관련된 연구로는 Bae4)등은 난소를 적출 한 rat에서 홍화씨분말의 골다공증예방효과를 확인하였으며, Kim5)등은 난소를 적출한 rat에서 홍화씨 분말이 혈청내 insulinlike growth factors, insulin-like growth factor binding protein-3 and bone alkaline phosphatase을 높임으로서 골다 공증 치료에 효과가 있다고 보고하였으며 Kang6)등은 홍화씨 추출물의 치주인대세포와 조골유사세포에서 골 광물화를 촉진 한다고 보고하였으며, Kim7)등은 홍화씨 분말의 급여는 골절의 치유과정에서 골조직의 회복속도를 빠르게 하여 치유에 걸리 는 시간을 단축시키는 효과가 있다고 보고하였으며, Song8)등 은 골결손시 홍화씨의 섭취는 신생골 형성을 촉진(1.5주 단축), 뼈의 석회화 과정을 유도하여 치유기간을 단축한다고 보고하 였으며, Park9)등은 홍화씨 분말이 골절 치유를 촉진(1.5주 단 축)한다고 보고하였으며, Seo10등은 성견의 치조골과 경골 결 손부에 홍화씨 추출물의 국소투여가 골세포에 자극을 주어 골 형성을 촉진하는 동시에 염증반응 감소 및 파골세포의 작용을 억제하여 골 재생과정을 촉진시킨다고 보고하였다.
우슬(Achyranthes Radix)는 쇠무릅의 뿌리이며, 구성성분으 로는 olenilinc acid, saponin, metamorphosis hormone, β -sitosterol, stigmasterol, stigmasterol glycoside 및 rubrosterone 등이 보고되었고, 약리작용으로는 진통, 진경, 이뇨, 항알러지 등의 효과가 있는 것으로 알려지고 있다11). Kim12)등은 우슬 추출물이 RANKL에 의한 파골세포 분화를 억제하고 염증성 골 손실을 억제한다고 보고하였고, Choi13)등은 골다공증의 유발 제인 카드뮴(cadmium)에 의해 감소된 골모세포 생존율을 증 가시키고 항산화효과로 세포독성을 방어한다고 보고하였다.
마가목은 각종 풍과 어혈을 낫게 하고 뼈를 튼튼하게 하며 성 기능을 개선하고 저린 증상을 치료 한다고 알려져 있으며, 천식, 폐결핵 같은 폐 질환 치료에도 이용되어 왔다. 특히 줄 기와 껍질에 풍부한 베타시토스테롤 성분은 나쁜 콜레스테롤 과 지방 성분을 분해하기 때문에 다이어트와 혈액 순환에 효 과적인 것으로 알려져 있다14). Kim15)등은 마가목 추출물이 조 골세포 분화를 촉진한다고 보고하였고, Moon16)등은 마가목 과 현지초 혼합추출물이 파골세포의 분화를 억제하고 연골세 포의 분화를 촉진한다고 보고하고 있다.
홍화씨, 우슬 및 마가목 외 다른 부수적인 약재를 첨가하여 복합추출액을 제조하였다. 약재 성분의 추출률을 높이기 위해 약재를 추출하기 이전에 두 가지 효소를 처리하여 약재 성분 의 추출률을 높였다. 또한 본 실험에서는 인간 골수 유래 중간 엽 줄기세포를 이용하여 골분화 유도과정에서 복합추출액의 조절 여부를 확인하였다.
Ⅱ. MATERIALS and METHODS
1. 실험재료
실험에 사용한 뼈 증강을 위한 생약 혼합 추출물은 홍화씨, 우슬, 마가목, 황기, 오갈피뿌리, 엄나무, 헛개나무, 대추, 상지 를 넣은 혼합물로 ㈜가고파 힐링푸드(창원시, 대한민국)에서 제공받았다. 생약의 추출률을 높일 수 있는 상업적인 효소인 pectinasc[pezyme(α-amylase), rohament (L-cellulase & hemicellulase), plantase, pectinex]와 proteinase[alcalase, flavourzyme, protamex] 등 두 가지 효소를 약초에 먼저 처리 한 후 추출하여 추출액을 준비하였다. 액체로 얻은 시료는 0.2 um 필터 페이퍼를 이용 하여 한 번 걸러 준 뒤 동결 건조하여 파우더 형태로 만들어 실험에 사용하였다. 본 추출물의 명칭은 natural-herb mixture extract의 약자를 따라서 NME라고 명시하였다
2. 세포배양
인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 PromoCell(Heidelberg, Germany)에서 구매하여 사용하였다. 배지는 StemMACS™ MSC Expansion Media Kit XF, human 배지는 Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)에서 구매하여 사용하고 5% CO2, 37 ℃ 조건에서 배양하였다. 세포를 배양 할 때, thawing 하는 세포의 수는 1 cm2당 4000 cells을 기준으로 하였으며, 3일 마다 새 배지로 갈아 주었다. 실험에 사용한 세포는 passage 3-6 사이의 세포를 사용하였다.
3. 세포의 분화
세포 분화를 위하여 well plate에 세포를 seeding 한 후, 세포의 밀도가 100%가 되면 골 분화를 유도하였다. 골 분화 배지인, StemMACS OsteoDiff Media(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 구매하여 8일 동안 분화를 유도하였 다. NME는 1, 10 그리고 100 ug/mL의 농도로 3일에 한 번 씩 새 배지로 교환시, 분화기간 동안 각각 처리 하였다.
4. 세포 생존률 측정
48 well plate에 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 3x103 cells/well로 seeding 한 뒤 하루 동안 안정화시킨다. 안정화시 킨 후 NME를 1, 10 그리고 100 μg/mL의 농도로 처리 하였다. 세포 생존률의 측정은 분화를 바로 시작하기 직전을 0일로 하고 하루 간격으로 3일 까지 총 네 번 세포의 생존률을 측정하였다. 세포의 생존률을 측정하는 방법은 Thiazoyl blue tetrazolium bromide(MTT) assay를 통하여 실시하였다.
5. Alkaline phosphatase (ALP) 염색
48 well plate에 1x104 cells/well로 세포를 seeding 한 뒤, well plate의 밀도가 100%가 되면 골분화를 시작하고 총 4일 동안 진행하였다. 골분화 진행 후 4일 뒤, ALP 효소 활성을 측정하기 위하여 ALP staining kit(86R-1kt, Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO, USA)를 사용하여 염색을 실시하였다. 실험 방 법은 kit에서 제공하는 실험 방법에 따라 진행 하였다. ARS의 정량 분석을 위하여 National Institutes of Health의 Image J 소프트웨어를 사용하여 intensity를 측정하여 나타낸 값을 NME 없이 분화한 세포를 기준으로 상대적인 값을 나타내었다.
6. Alizarin Red S 염색법
48 well plate에 1x104 cells/well의 밀도로 세포를 seeding 한 후 3항과 같이 골분화 배지에 추출물을 처리하였다. 분화를 유도하고 8일 뒤, 미네랄 형성을 측정하기 위하여 2% Alizarin Red S solution을 사용하여 염색을 실시하였다. ARS의 정량 분 석을 위하여 National Institutes of Health의 Image J 소프트웨 어를 사용하여 intensity를 측정하여 나타낸 값을 NME를 처리 하지 않고 분화한 세포를 기준으로 상대적인 값을 나타내었다.
7. RNA isolation와 cDNA 합성
인간 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 RNA isolation을 위하 여 골 분화를 6 well plate에서 실시하였다. 8일 동안 골 분화를 유도시킨 뒤, PBS를 사용하여 well을 세척해 주고 FavorPrep ™ Tri-RNA reagent(FAVORGEN biotech corp., Ping-Tung, Taiwan)를 1 mL 넣어 준 뒤 pipetting을 방법으로 cell을 충분 히 lysis 시킨다. RNA isolation 방법은 FavorPrep™ Tri-RNA reagent에서 제공하는 방법에 따라 실험을 실시하였고, RNA isolation한 뒤 정량방법은 nanodrop(Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) 을 사용하여 정량하였다.
정량한 RNA를 total 2 μg으로 cDNA를 합성하였다. cDNA 의 합성은 AccuPower® RT PreMix(Bioneer, Daejeon, Korea) 를 이용하여 주어진 방법에 따라 두 단계로 진행하였다.
8. RT-PCR
합성한 cDNA를 이용하여 2X-ready go premix kit(Nanohelix, Daejeon, Korea)를 이용하여 PCR을 진행하였다. PCR을 실시 한 방법은, 95℃, 2 min 동안 denaturation, annealing 단계는 95℃, 20 sec, 55℃ ~ 60℃에서 40 sec, 72℃에서 45 sec 조건으 로 27-32 cycle 동안 실시하였다. 사용한 primer의 sequence는 Table 1에 명시하였다. PCR product는 2% agarose gel에 전 기영동을 내린 뒤, UV를 이용하여 band를 확인하고, 얻은 band는 National Institutes of Health의 Image J 소프트웨어를 사용하여 band를 정량 분석하였다.
9. 통계 처리
본 실험의 통계 처리는 Excel을 이용하여 평균값과 표준오 차(SEM)를 이용하여 그래프를 그리고 Student’s t. test를 이용 하여 유의적 차이를 나타내었다. 유의성은 P값 0.05 이하에서 나타내었다. *P ≤ 0.05와 **P ≤ 0.02 로 나타내었다.
Ⅲ. RESULTS
1. NME 농도에 따른 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포 증식 정도 확인
NME의 인간 골수유래 중간엽 줄기세포에 대한 독성이 미치 는 않는 농도를 확인하기 위해 MTT assay를 수행한 결과, 본 실험에서 사용한 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않는 것 을 확인하였다. Fig. 1에서 나타난 바와 같이 1 ug/mL의 제일 낮은 농도에서는 세포 증식률이 대조군과 크게 차이 나지 않으 나 10 ug/mL과 100 ug/mL에서는 세포증식률이 대조군에 비해 증가 하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 100 ug/mL농도에서는 1일째부터 유의성 있게 증가하여, 3일째에는 1.3배정도 증식률 이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이 실험 결과 NME는 골수유 래 중간엽 줄기세포를 증식시키는 효과가 있음을 확인하였다.
2. NME 처리에 의한 ALP 활성 확인
NME의 인간 골수유래 중간엽 줄기세포의 ALP활성에 미치 는 영향을 확인하고자 ALP염색을 하였다. 앞선 실험 결과를 토대로 1, 10, 100 ug/mL 농도의 NME를 인간 골수유래 중간엽 줄기세포에 처리하여 4일 동안 분화를 진행시킨 후 염색하였 다. 그 결과, Fig. 2에 나타난 바와 같이 NME를 처리한 그룹에 서 처리하지 않은 그룹에 비해 유의하게 활성이 증가하는 것을 확인하였으며, NME의 농도가 증가함에 따라 ALP의 활성도 함 께 증가 되었다는 것은 분화를 촉진 하는 것을 의미한다.
3. NME 처리에 의한 미네랄 형성정도 확인
인간 골수유래 중간엽 줄기세포의 골분화시 칼슘이 형성되 며, 칼슘이 형성되는 것을 확인하기 위하여 ARS staining을 실시하였다. NME를 1, 10, 100 ug/mL의 농도로 인간 골수유 래 중간엽 줄기세포를 8일 동안 배양한 후 염색한 결과 NME 를 처리한 그룹에서 처리하지 않은 그룹에 비해 유의하게 Alizarin red S 염색이 증가하는 것을 확인하였다. ARS 염색 결과 추출물의 농도가 10 ug/mL로 증가하면 미네랄 형성 역 시 20배 이상 유의성 있게 증가하는 것을 알 수 있었다(Fig. 3). 미네랄 결절 형성정도를 증가시키는 것은 골분화 유도를 촉진하는 것을 의미한다. 따라서 NME는 모든 농도에서 골 분 화를 촉진함을 확인하였다.
4. NME 처리에 의한 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포의 골 분화 마커의 발현
ALP활성과 미네랄 형성정도 측정 실험결과를 토대로 NME 를 통한 인간 골수유래 중간엽 줄기세포의 골분화 마커의 발 현을 조절할 것이라는 가능성을 확인하였고, 이를 실험적으로 증명하고자 RT-PCR을 실시하였다. 골수유래 중간엽 줄기세포 에 NME (1, 10, 100 ug/mL)를 처리하였다. 그 결과 NME에 의한 골분화 마커인 ALP, OCN, OPN의 mRNA 발현이 증가하 는 것을 확인하였다(Fig. 4). ALP의 경우에는 분화를 진행하 지 않은 대조군 에서는 발현이 없다가 NME 추출물을 100 ug/mL 처리한 실험군 에서 추출물을 처리 하지 않고 분화시 킨 그룹보다 약 6배 정도 ALP 발현이 증가하였으며, OCN의 경우는 약 7.5배, OPN의 경우에는 약 1.7배 증가하는 것을 확인 하였다. NME 추출물이 골분화 마커의 발현을 증가시킴 을 확인하였다.
Ⅳ. DISCUSSION
천연물을 이용한 전통적인 치료법은 수천년동안 다양한 질 병 치료에 이용되어왔다. 골다공증 치료에서도 천연물을 이용 한 연구들이 많이 이루어지고 있다17). 골다공증치료에 많이 이 용된 천연물은 홍화씨, 우슬, 마가목 등이다. 본 연구에서는 홍 화씨, 우슬, 마가목을 주재료로 하는 생약 혼합 추출물(NME)을 이용하였으며, 추출 수율을 높이기 위해 효소처리를 두 번 실시 한 뒤 추출물을 얻었으며, 이 추출법은 특허로 출원되었다18).
골다공증치료와 관련된 이전 연구들은 조골세포의 분화촉진 과 파골세포의 억제에 초첨을 맞추어 이루어져 왔다. Jiao19)등은 음양곽 성분 icariin이 MAPK 신호전달 경로를 통한 액틴 스트레 스 섬유형성을 촉진시켜 골수유래 중간엽세포의 이동능력을 향 상시켜 연골 결손 치료를 위한 효과적인 방법이라고 보고하였 다. 그 외 골수 유래 줄기 중간엽 줄기세포가 골조직으로 분화하 는 과정에서 생약혼합추출물이 어떤 영향을 미치는지에 대한 연 구는 거의 없어 선행연구와의 비교검토는 어려운 상황이다.
NME의 인간 골수유래 중간엽 줄기세포의 세포증식률과 ALP활성에 미치는 영향을 분석한 결과 효소처리를 한 추출물 이 효소처리를 하지 않은 추출물에 비하여 전반적으로 활성이 높아지는 경향을 보였다(data 표시 안함). 따라서 본 실험에서 는 효소처리를 한 추출물을 시료로 하였고 추출물을 물에 녹 여 인간 골수유래 중간엽 줄기세포를 골세포로 분화시키는 동 안 처리하여 골분화 척도를 분석하는 실험을 실시하였다.
MTT assay을 통하여 골수유래 중간엽 줄기세포에서 NME 의 독성여부를 확인하였다. 1, 10, 100 ug/mL의 모든 농도에 서 독성을 나타내지 않았으며 시일이 지날수록 세포를 증식시 킴을 확인할 수 있었다. 제일 낮은 농도인 1 ug/mL은 대조군 과 비교하여 별 차이가 없었으나 10 ug/mL에선 2일째부터 유 의성있는 증가율을 나타내고 있다. 제일 높은 농도인 100 ug/mL에선 배양 1일부터 유의성있게(111%) 세포를 증식시키 고 배양 3일째에는 125% 증가율을 보이고 있어 세포증식을 촉진시키고 있음을 확인하였다.
골 석회와와 골형성능은 골분화에 중요한 표식자이다. 우 선 인간 골수유래 중간엽 줄기세포에 NME를 처리하여 골세 포로 분화가 되는지 ALP염색과 ARS염색을 통해 확인하였다. 대조군에 비해 확연하게 분화가 유도 되는 것으로 나타났다. ALP는 유기인산 에스테르를 가수분해하여 석회화가 이루어지 는 부위에서 국소적으로 인산이온의 농도를 증가시키는 효소 로써, 세포외기질에 calcium phosphate를 침착시켜 석회화를 유도하는 기능을 갖는다고 알려져 있다20-22). De Bemard23)는 ALP가 국소적으로 인산이온 농도를 증가시켜 단백질을 인단 백으로 전환시키고 이것이 칼슘결합 성향을 가지면서 석회화 의 핵으로 역할을 한다고 보고하였다. 본 연구에서 NME에 대 한 ALP염색은 골분화 시작 후 4일 뒤 실시하였고, ALP 합성량 을 측정한 결과 골수유래 중간엽 줄기세포에서 모든 농도에서 유의성 있게 증가하였음을 확인하였다.
골 분화 마커 유전자의 발현을 RT-PCR로 확인하였다. ALP 의 경우 초기 골분화의 마커 유전자이며, OCN과 OPN의 발현 은 골 분화 중기에 나타나는 마커이다. 분자수준에서 확인한 골 분화 마커 유전자의 발현 역시 대조군 보다 NME를 처리한 실험군에서 높은 발현량을 나타내었고 유의적인 차이를 보였 다. 이들 결과를 종합해 보면, 홍화씨, 마가목, 우슬을 주재료 로 한 NME는 인간 골수유래 중간엽 줄기세포가 골조직으로 의 분화하는 과정을 촉진한다는 것을 알게 되었다.
따라서 NME는 골세포 분화나 기능을 조절할 수 있는 물질 로 개발하여 골질환을 치료하고 에방할 수 있는 물질로 개발 가능할 것이며, NME가 어떤 신호전달경로로 인간 골수유래 중간엽 줄기세포에서 골조직으로의 분화를 촉진시키는지에 대한 후속연구가 필요할 것이다.
