Ⅰ. INTRODUCTION

최근 수십 년간 의료계에서는 질병 및 사고 등으로 인해 상실된 골 조직을 재건하고자 하는 노력이 이어져 왔고, 그 결과 골 재생재료(bone regeneration materials)에 대한 많은 연구와 함께 효율적으로 골을 재생하기 위한 골 조직공학 (bone tissue engineering)의 분야의 큰 발전을 이루었다.

구강악안면영역에서도 생체의 자가 재생기능에 준하는, 상 실 조직의 성공적 재건을 위한 생체재료가 개발될 것으로 기 대되며, 특히 임플란트와 관련하여 상실된 골 조직을 재건하 고자 다양한 골 재생재료와 골 조직공학기술이 대두되었다. 현재 상실된 골 조직을 대체하기 위해 많이 사용되고 있는 골 재생재료로는 자가골, 동종골, 이종골, 합성골 등을 많이 쓰고 있다¹⁾. 자가골은 골 재생에 가장 효과적이나 채취가 제한적이 며, 이를 대체하는 다양한 합성골들이 상업적으로 판매되고 있 다. 그러나 현재 합성골은 자가골의 장점을 얻기엔 부족하며 만 족할만한 골 유도(osteoinduction)와 골 전도(osteoconduction) 를 얻기는 어렵다^1,2). 이러한 합성골이 가진 한계를 극복하기 위해 골 조직공학용 비계(scaffold) 개발, 골세포(osteocyte)의 이식, 부가적인 세포성장인자의 투입방식을 통해 생체활성도 가 높은 인공생체재료개발이 필요하게 되었고 이와 관련하여 줄기세포 배양이식 기술이 소개되어 각광을 받고 있다³⁾.

골 재생, 재건에서 효율적인 조직 공학적 골 형성을 위해서는 세포, 비계, 성장인자 등의 3가지 필수요소가 있으며, 이외에 적 용가능한 제 4요소로서 세포에의 기계적 자극 등을 통한 세포분 화 촉진방식이 있다^3,4,5). 최근 많은 문헌들에 의해 줄기세포로부 터의 보다 효율적인 세포 분화와 골 재생능력의 신장을 위해서는 분화인자와 비계 이외에도 인체에서 세포들이 경험하게 되는 물 리적인 자극 또한 필요하다는 사실들이 보고되고 있다^4,5). 따라 서 생체역학의 원리를 응용한 술식이 적용될 때 보다 효과적인 골 재생을 위한 인공이식환경을 만들 수 있을 것으로 생각된다.

최근 지속적인 느린 신장력을 전달할 수 있는 세포배양기가 소개되었고⁶⁾, 조직재생으로 만들어진 연골에 기계적 힘의 자극을 통한 재생골의 강도를 높이는 방식 등이 보고되고 있다⁵⁾. 그러나 기계적 장력과 저출력 초음파(low intensity pulsed ultrasound, LIPUS)의 세포자극 결과를 비교 보고한 연구는 아직 없고, 이러한 세포자극이 접목되어 세포배양능을 가진 기능성 비계에 대한 연 구가 부족한 실정이다. 이에 세포에 인장력을 적용할 수 있는 세 포배양기를 이용하여 기계적 장력과 저출력 초음파가 세포 배양 시 세포 분화에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

Ⅱ. MATERIALS and METHODS

1. 실험 재료

1) 세포 배양

MG-63 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)에서 구입하여 사용하였다. 이 세포는 100μg/ml penicillin/ streptomycin, 4mM L-glutamine, 10% fetal bovine serum (FBS)를 첨가한 Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM) 배지를 이용하여 37℃의 5% CO₂ humidified air incubator에 서 배양하여 유지하였다.

2) 시약 및 재료

DMEM, FBS, penicillin/streptomycin은 Gibco(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. L-ascorbic acid 2-phosphate, dexamethasone, β-glycerophosphate, Alizarin red S, p-Nitrophenol, Alkaline Phosphatase Yellow(pNPP) Liquid Substrate System for ELISA은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

3) 기계적 장력과 저출력 초음파 기기

① Flexcell-like bioreactor 세포배양기

배양 세포에 여러 가지 조건의 기계적 장력 자극을 적용하기 위하여 부산대학교 의과대학 의공학과 교수진과의 공동연구를 통해, 현재 많이 사용되는 기계인 Flexcell FX-5000 Tension System(Fig. 1a, 1b)³⁾과 유사한 세포배양기를 직접 제작하였 다. 이 세포배양기의 원리는 공기압축기(air-compressor)를 가 동하여 생성된 공기압을 컴퓨터로 제어하여 미세한 장력이 세 포에 적용되게 설계된 세포 배양판에서 세포 배양을 할 수 있 도록 설계하였다(Fig. 1c, 1d, 1e).

② 저출력 초음파 기기

본 연구에서 사용한 저출력 초음파 기기는 현재 임플란트 식립 후 골세포(osteocyte) 활성화를 위하여 임상적으로 많이 사용되고 있는 BR-Sonic 초음파 장비(BR Sonic company, Tokyo, Japan)를 사용하였다(Fig. 2).

2. 실험 방법

1) 기계적 장력 적용

콜라겐이 코팅된 장력 전용 Tension 6-well plate(Flexcell, Flexcell International Corp, Hillsborough, North Carolina, USA)에 MG-63 세포를 3×10⁵ cells/well의 밀도로 분주하여 100% confluence가 되도록 배양하였다.

기계적 장력 적용 조건은 2가지로서, sine파형의 장력자극으 로 0.5Hz 값에서 1일 8시간 적용 조건과, sine파형의 장력자극 으로 0.7Hz 값에서 1일 2시간, 1일 4시간, 1일 6시간의 조건으로 적용하였다. 이후 골형성 유도 배지(50μg/ml L-ascorbic acid 2-phosphate, 10nM dexamethasone, 10mM β-glycerophosphate, 10% FBS가 포함된 DMEM)로 바꾸어 골모세포로의 분화를 유 도한 다음 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase) 활 성도, Alizarin red S 염색 후 골기질 형성 정도, 탈회 후 칼슘 의 양을 각각 측정하였다.

2) 저출력 초음파 조사

저출력 초음파 조사 조건은 2가지로서, BR-Sonic 초음파 장 비를 이용하여 3MHz 30% 160mW에서 1일 15분간 조사하여 3일간 자극을 주었다. 또한 1MHz 30% 160 mW에서 1일 15 분, 3MHz 30% 160mW에서 1일 15분의 2가지 조건으로 1일 간만 조사하는 조건으로 바꾸어 초음파자극을 조사하였다. 이 후 골형성 유도 배지(50μg/ml L-ascorbic acid 2-phosphate, 10nM dexamethasone, 10mM β-glycerophosphate, 10% FBS 가 포함된 DMEM)로 바꾸어 골모세포로의 분화를 유도한 다 음 알칼리성 인산분해효소 활성도, Alizarin red S 염색 후 골 기질 형성 정도, 탈회 후 칼슘의 양을 각각 측정하였다.

3) 알칼리성 인산분해효소 활성도 측정

자극을 부여하고 골형성 유도 배지에서 배양한 세포를 모 아 인산완충생리식염수(phosphate buffer saline, PBS)로 수 세한 후 0.5% Triton X-100을 첨가하여 용해시키고 세포막을 파괴한 후 상층액만 분리하여 bradford법으로 정량하였다. 각 군의 상층액 20μl를 100μl p-NPP를 첨가하여 37℃에서 15분 간 반응시켰다. 0.2M NaOH로 반응을 중단시킨 후 ELISA reader로 405nm에서 흡광도를 측정하였고 효소 활성은 p-nitrophenol을 기준으로 하였다.

4) Alizarin red S 염색

자극을 부여하고 골형성 유도 배지에서 배양한 세포를 모 아 PBS로 2번 수세한 후, 10% formaldehyde로 실온에서 15분 고정한 후 pH 4.2의 2% Alizarin red S로 10분간 염색하였다. 증류수로 여러 번 세척한 후, Alizarin red S에 결합된 칼슘이 녹아 나오도록 100mM cetylpyridinium chloride 용액에 2시 간 처리하였다. 녹여진 상층액에서 각 200μl를 분리하여 ELISA reader를 사용하여 흡광도 570nm에서 측정하였다.

5) Calcium 양의 측정

자극을 부여하고 골형성 유도 배지에서 배양한 세포를 모 아 PBS로 2번 수세하였다. 24시간 동안 세포를 0.6N 염화수 소(HCl) 용액으로 탈회시키고 각 군의 상층액을 Calcium colorimetric assay kit를 사용하여 형성된 칼슘에 대한 정량적 평가를 실시하였다.

6) 통계

실험군과 대조군의 결과는 SPSS(Statistical Package for the Social Sciences version 12.0, Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하여 paired T-test를 적용해 분석했다. 유의성 검증은 p<0.05인 경우 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

Ⅲ. RESULTS

1. 알칼리성 인산분해효소 활성도 측정 결과

기계적 장력을 1일 8시간 적용한 실험군과 저출력 초음파 3MHz를 15분씩 3일간 조사한 실험군은 대조군에 비해 알칼 리성 인산분해효소 활성도가 유의하게 증가하였다(Fig. 3).

3일, 7일, 12일 간격으로 알칼리성 인산분해효소 활성도를 측정한 결과, 실험군과 대조군의 알칼리성 인산분해효소 활성 도 수치가 증가하는 경향을 보였다.(0.04∼2.5units/μl)(Fig. 4) 7일째 측정 결과에서는 0.7Hz의 기계적 장력을 2시간, 4시 간, 6시간 적용해준 실험군의 알칼리성 인산분해효소 수치는 각각 0.25units/μl, 0.38units/μl, 0.53units/μl로 대조군 알칼리 성 인산분해효소의 수치인 0.17units/μl보다 모두 증가하였으 며, 자극 시간 길이에 비례하여 증가하였다. 12일째 측정 결과 도 대조군(2.3units/μl)의 알칼리성 인산분해 효소 활성도에 비 해 실험군의 경우 각각 2.4units/μl, 2.6units/μl, 2.7units/μl로 증가하였다.

실험군 중에서는 0.5Hz 기계적 장력을 6시간 적용해준 경 우가 알칼리성 인산분해효소 활성도 수치가 가장 높았으며, 저출력 초음파 조사 역시 대조군에 비해 높은 알칼리성 인산 분해효소 활성도 수치를 나타내었고, 12일간 세포배양한 1MHz군(0.3units/μl)보다는 3MHz군의 결과(0.35units/μl)가 유의성 있게(p<0.05) 증가하였다(Fig. 4).

2. 골기질 형성 평가

Alizarin red S로 염색한 후 ELISA reader를 사용하여 흡광 도 570nm에서 측정한 결과, 기계적 장력(0.5Hz 1일 8h) 자극 을 주고 3주간 배양한 경우의 칼슘양은 3.8의 수치를 보였으 며, 대조군의 3.5 수치보다 증가한 것으로 나타났다.

저출력 초음파(3MHz)를 적용하고 3주간 배양한 실험군의 세포에서는 대조군의 3.5와 같은 수치로 나타나 차이가 없었 다. 그러나 4주간 배양한 실험군의 경우 대조군(3.5)에 비해 1일 8시간 0.5Hz 기계적 장력을 받은 그룹은 4.1의 수치로, 3MHz저출력 초음파를 받은 그룹은 3.8 수치로 나타나 대조군 보다 증가하였다.(Fig. 5, 6)

기계적 장력을 1일 6시간 적용한 경우와 저출력 초음파 3MHz를 1일 15분간 조사한 경우가 칼슘양이 증가하였다(Fig. 6, 7).

3. Calcium colorimetric assay 결과

Calcium colorimetric assay kit를 사용하여 생성된 칼슘의 양을 정량화한 결과에서는 0.7Hz의 기계적 장력을 1일 6시간 적용한 경우에서만 칼슘 양이 유의성있게 증가하였다.

세포에 기계적 장력 적용 후 3주 뒤에 측정한 대조군의 칼슘 양은 2.2μg/ml로 나타났고 기계적 장력을 적용한 그룹은 2.0μ g/ml로 대조군보다 오히려 감소하였다. 반면 저출력 초음파를 조사한 그룹은 2.3μg/ml로 대조군보다 증가하였다. 세포 자극 후 4주 뒤에 측정한 칼슘의 정량적 수치는 3주 후 측정한 경우 보다 실험군과 대조군 모두 낮게 관찰되었다. 대조군은 2.0μ g/ml, 기계적 장력을 적용한 실험군은 1.5μg/ml, 저출력 초음 파를 조사한 실험군은 2.2μg/ml를 나타내었다(Fig. 6).

자극 부여 후 세포배양 12일과 17일 후 칼슘의 양을 측정한 결과, 대조군의 수치인 3.5보다 실험군의 칼슘양이 더 높은 수치를 보였다. 기계적 장력의 적용시간에 따른 칼슘의 양은 6시간이 가장 높았고 4시간, 2시간 순서로 낮았다. 저출력 초 음파자극의 경우에도 대조군의 수치인 3.5보다 실험군에서 1MHz에서는 4.1, 3MHz에서는 4.0으로 모두 높게 관찰되었 다. 세포배양 12일의 결과에서는 6시간의 기계적 장력 적용이 1.1μg/ml로 대조군의 0.75μg/ml보다 월등히 유의성 있게 높 았다.(p<0.001) 세포배양 17일의 결과에서도 기계적 장력을 1일 6시간 적용한 그룹이 2.6μg/ml의 수치를 보여 대조군의 2.4μg/ml 보다 유의성있게 높게 나타났다(p<0.01)(Fig. 8).

Ⅳ. DISCUSSION

골조직의 재생에서 성공적인 결과를 얻기 위해서는 효율적 인 골모세포 분화와 골 재생능력의 확보가 필수적이다. 이를 위해 분화인자와 비계 이외에도 인체에서 세포들이 경험하게 되는 물리적인 자극 또한 세포 분화에 영향을 미치며³⁾, 특히 Distraction osteogenesis와 같이 기계적 장력이 골세포 분화 에 긍정적인 영향을 끼친다는 것은 잘 알려져 있다⁴⁾. 이에 본 연구에서는 세포들이 경험하게 되는 물리적인 자극 중 기계적 장력과 저출력 초음파를 이용하여 골모세포 분화와 골 재생능 력을 비교하였다. 골육종세포인 MG-63 세포는 배양을 하게 되면 골모세포양 세포(osteoblast-like cell)가 된다⁸⁾. 이 세포 가 분화하면서 생성되는 세포내의 무기질 양과, 분화하는 세 포의 세포막 바깥쪽 표면에 있는 다량의 알칼리성 인산분해효 소의 활성도를 비교 분석하는 것은 골모세포의 효율적인 분화 를 평가하기에 적합하다고 판단하여 본 실험에 적용하였다.

알칼리성 인산분해효소의 기능은 알칼리성 산도(alkaline pH)에서 유기기(organic radicals)로부터 인산(phosphate) 이온 을 가수분해해서 광화부위에 이온을 공급하며 수산화인회석결 정에 붙어서 결정성장을 방해하는 피로인산(pyrophosphate)를 파괴하여 결정의 성장이 진행되도록 한다^9,10). 골세포는 간질성 간세포(Stromal Stem Cell)-골선조세포(Osteoprogenitor)- 전 골모세포(Preosteoblast)-골모세포(Osteoblast)-골세포 (Osteocyte)의 순서로 분화된다. 이때 알칼리성 인산분해효소 는 골세포의 분화과정 중 전골모세포와 골모세포에서 양성으 로 나타나며, 골세포가 완성되면 알칼리성 인산분해효소는 음 성으로 나타난다¹¹⁾. 즉, 증식능이 왕성한 분화초기에 전골모 세포나 골모세포가 많을 때에는 알칼리성 인산분해효소의 수 치가 증가하게 되지만, 분화가 더 진행되어 골모세포가 골기 질을 분비함에 따라 골기질에 둘러싸여 소강(lacuna)안에 갇 히게 되는 골세포가 증가하면 알칼리성 인산분해효소의 수치 는 감소하게 된다.

본 연구 결과, 알칼리성 인산분해효소의 활성도 수치는 실 험군과 대조군 모두에서 2주부터 3주까지 꾸준히 증가하였고 반면 3주에서 4주에서는 거의 증가하지 않았다. 이로써 MG-65 세포를 분화시킨 결과, 4주 이후에는 골모세포에서 골 세포로 분화되는 경향을 보인다고 생각하였다. 이 결과로, 골 모세포가 골세포로 분화하는 시간을 4주로 판단하였고, MG-63 세포의 골모세포 분화는 1주에서 2주 사이에 가장 활 발하므로¹²⁾, 다시 3일, 12일, 17일의 주기로 골모세포의 분화 양상을 관찰하였다. 알칼리성 인산분해효소의 활성화 수치와 골기질 형성 평가 결과, 골모세포의 분화 과정에서 기계적 장 력의 적용과 저출력 초음파의 적용은 초기 골모세포 분화에 효과가 있다고 분석되었으며, 이는 Buckley 등의 보고와도 일 치하였다¹³⁾. 추가 실험으로, 생성된 칼슘을 세포탈회 후 흡광 도를 이용하여 분석한 결과를 보면 3주와 4주에서 생성된 칼 슘의 양은 비슷하였다. 그러나 12일과 14일의 결과를 보면 기 계적 장력이 0.7Hz로 6시간 적용된 경우에서 다른 실험군과 대조군보다 더 많은 칼슘이 검출되었다.

본 연구 결과 기계적 장력이나 저출력 초음파 등의 물리적 자 극이 골모세포의 분화에 영향을 미치는 것으로 나타났다^14,15,16). 또한 임플란트의 매식과 골이식의 증례에서 골 이식 후 골 성 숙 및 형성을 촉진하기 위하여 기계적 장력이나 저출력 초음파 와 같은 물리적 자극을 부여함으로써 골조직의 빠른 성숙과 효과적인 임플란트 골유착을 촉진할 수 있는 가능성을 제시하 였다. 기계적 장력이 세포분화 촉진을 가져오는 기전연구로는 Boutahar 등¹⁴⁾이 골모세포에 1%의 0.25Hz로서 10분간 지속적 장력 자극시 Mitogen-activated protein kinase(MEK) 경로 활 성화가 매개되고 이는 Focal adhesion kinase(FAK)과 Pyk2 phosphorylation 조정을 통해 Extracellular Signal- Regulated Kinase(ERK) 2 포스포린화에 의해 유도되는 기전을 통해 골 모세포 분화를 촉진한다고 보고하였다. 또한 Tabuchi 등¹⁵⁾은 1.5MHz 저출력 초음파를 20분간 백서의 전구 골모세포들에 조사시 유전자의 변화를 관찰한 결과 Bglap 유전자의 mRNA 수치 상승을 관찰하였고 Microarray 분석상 38개 유전자의 과 발현과 37개 유전자의 저발현이 저출력 초음파 조사 전에 비 해 1.5배 차로 발현양상이 변화함을 관찰하고 과발현 유전자 들과 골모세포의 형태변화 간에 상관있음을 보고한 바 있다. 이로서 기계적 장력과 저출력 초음파 모두 세포의 분화에 영 향력을 미침을 여러 연구보고에서 확인되었다.

실험 결과 저출력 초음파와 기계적 장력 적용 조건의 비교 에서 세포 자극에 따른 골모세포 분화의 결과는 비슷한 것으 로 나타나, 두 가지 방식 중 어떤 물리적 자극 방식이 골조직 생성에 월등히 효과가 있다고 판단하기는 어려운 것으로 생각 된다. 또한 본 연구 결과를 임상적으로 적용하기 위해서는 골 재생을 촉진하기 위하여 인체에 기계적 장력 등의 생체 역학 적 자극을 구체적으로 적용할 것인지에 대한 후향적 연구가 필요하며, 보다 다양한 자극을 다양한 조건으로 적용하여 가 장 효과적인 생역학적 세포분화 자극조건을 확립하는 in vitro 실험과 in vivo 실험이 필요할 것으로 사료되었다.

Ⅴ. CONCLUSION

본 연구는 MG-63 세포의 골모세포 분화에 미치는 생역학 적 자극의 반응을 실험하였으며 본 연구진이 자체 개발한 세 포자극 배양기 및 저출력 초음파 장비를 이용하여 자극을 부 여한 MG-63 세포 배양시 다음의 결과를 얻었다.

이상의 결과 등을 종합해 보면 MG-63 세포에의 기계적 장 력 적용 및 저출력 초음파 조사는 골모세포 분화과정에 긍정 적 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.