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ISSN : 1225-1577(Print)
ISSN : 2384-0900(Online)
The Korean Journal of Oral and Maxillofacial Pathology Vol.43 No.5 pp.147-156
DOI : https://doi.org/10.17779/KAOMP.2019.43.5.002

Effects of Ninjurin1 on Osteoblast Differentiation

Juhwan Oh1), YunJeong Choi1),2), Mi Heon Ryu3), Moon-Kyoung Bae1),2), Hyung Joon Kim1),2)*
1)Department of Oral Physiology, School of Dentistry, Pusan National University
2)BK21 PLUS Project, School of Dentistry, Pusan National University
3)Department of Oral Pathology, School of Dentistry, Pusan National University
Correspondence: Hyung Joon Kim, Department of Oral Physiology, School of Dentistry, Pusan National University Tel: +82-51-510-8278, Fax: +82-51-510-8238 E-mail: hjoonkim@pusan.ac.kr
September 2, 2019 September 30, 2019 October 4, 2019

Abstract


Nerve injury induced protein 1 (Ninjurin1) was originally described in neuroscience in which the expression of Ninjurin1 was regulated by Schwann cells and dorsal root ganglion neuronal cells of damaged nerve tissues. After the first discovery of Ninjurin1, the widespread expression of Ninjurin1 in adult and embryonic tissues have been observed including bone marrow, peripheral blood lymphocytes, thymus, and heart. Currently, the Ninjurin1 mediated positive regulation of pre-osteoclasts fusion and osteoclast development was reported. The bone homeostasis is dynamically balanced by bone-resorbing activity of osteoclast and bone-forming activity of osteoblast. Until now, the role of Ninjurin1 was never been described in osteoblastogenesis. Therefore, in this study, we have evaluated the expression and function of Ninjurin1 in osteoblast. The ample expression of Ninjurin1 was observed in bone marrow of mouse tibia sections but it was barely expressed in osteocytes. And also the expression levels of Ninjurin1 were gradually increased during osteoblast differentiation of calvarial pre-osteoblast, C2C12, and MC3T3-E1 cells. Importantly, the expression of Ninjurin1 was increased in the absence of osteogenic stimulus, BMP2, which suggests the cell density-dependent regulation of Ninjurin1. The controlled expression of Ninjurin1 by cell-density was evidently shown in not only pre-osteogenic osteoblast lineage cells but also in non-osteogenic cancer cells such as HeLa and A549 cells. In addition, the isoform-specific knockdown of Ninjurin1 remarkably reduced the alkaline phosphatase (ALP)-positive osteoblast differentiation. Thus, our results suggest a previously unappreciated mechanism of Ninjurin1 expression and also suggest its role on osteoblastogenesis.


Ninjurin1 , Osteoblast , Cell density , Alkaline phosphatase

Ninjurin1이 골모세포의 분화에 미치는 영향

오 주환1), 최 윤정1),2), 유 미현3), 배 문경1),2), 김 형준1),2)*
1)부산대학교 치의학전문대학원 구강생리학교실
2)BK21플러스 사업단
3)구강병리학교실

초록

    Pusan National University

    Ⅰ. INTRODUCTION

    Ninjurin1은 sciatic nerve injury시에 Schwann cell에서 발 현이 증가하는 세포막 단백질로써 최초 발견되었으며, “nerve injury induced protein 1”을 축약하여 Ninjurin1으로 명명되었 다1,2). Ninjurin1의 대표적인 역할은 hemophilic interaction을 통한 axonal growth 촉진인 것으로 알려져 왔으나, 최근 다양 한 연구를 통해 신경 이외의 조직 및 세포수준에서 Ninjurin1의 역할이 보고되고 있다. 혈관 주위 macrophage에서 Ninjurin1 의 발현이 증가하면 Angiopoietin2와 Wnt7b 분비를 통해 혈 관내피 세포의 세포자멸사를 촉진한다는 연구가 보고된 바 있 으며3), 전립선암 세포가 Ninjurin1을 통해 비정상적인 세포이 동능을 획득하여 metastasis에 용이한 조건이 된다는 사실도 확인된 바 있다 4). 또한 근육세포의 성장과 분화를 Ninjurin1이 조절한다고 알려져 있으며5), 사람의 hepatocyte에서 Ninjurin1 에 의해 cellular senescence가 유발된다는 사실도 알려져 있 다6). 따라서, Ninjurin1은 신경세포 손상 시 발현이 증가하는 것으로 1996년 최초로 발견되었으나, 현재는 생체 내 여러 조 직에서 발현하고 있으며 해당 조직에서 특정 기능을 수행하고 있는 adhesion molecule로 받아들여지고 있다.

    우리 몸의 뼈는 골모세포 (osteoblast)에 의한 골형성과 파골 세포 (osteoclast)에 의한 골흡수가 끊임없이 일어나는 역동적 인 골재형성 (bone remodeling) 과정에 의해 균형을 유지하고 있다7,8). 골모세포는 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell) 에서 기원하고, 파골세포는 조혈모세포 (hematopoietic stem cell)에서 기원하므로 두 세포는 상이한 전구세포로부터 분화 되지만, 성숙한 골모세포 및 파골세포의 분화가 일어나기 위해 서는 두 세포 간의 상호작용 (osteoblast-osteoclast coupling) 이 반드시 필요한 것으로 알려져 있다 9,10). 예를 들자면, 골모 세포가 분비하는 싸이토카인인 M-CSF (macrophage-colony stimulating factor)는 미성숙 파골세포의 생존을 촉진하고, 또 다른 싸이토카인인 RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)은 파골세포 분화를 유도하는 필수인 자로 잘 알려져 있다11,12). 반면에, 파골세포가 분비하는 S1P (sphingosine-1-phosphate)와 ephrinB2는 골모세포의 분화를 촉진하는 인자로 보고되고 있다 13,14). 따라서, 최근 골생물학 연구 분야에서는 골모세포 및 파골세포의 단독 활성 변화보 다, 골모세포와 파골세포의 상호연계성에 초점을 맞추어야 한 다는 관점이 정설로 자리잡고 있다.

    Ninjurin1 유전자는 hereditary sensory neuropathy와 같은 유전병 원인유전자와 염색체상 동일한 위치에 자리잡고 있으 므로, Ninjurin1 돌연변이에 의한 질환이 존재할 것으로 예상되 고 있으나, 아직까지 Ninjurin1 돌연변이에 의한 질병은 보고된 바가 없다15). 하지만 흥미롭게도, 류마티스성 관절염 환자와 폐경으로 인한 골다공증 환자의 골수 단핵세포 (monocyte)에 서 Ninjurin1 발현이 높다는 사실이 최근 발표된 바 있다16). 이것은 Ninjurin1의 발현이 골대사에 영향을 줄 수 있다고 보고 한 첫 번째 연구로서, 해당 논문에서는 macrophage에서 발현 하는 Ninjurin1이 전구 파골세포의 융합을 촉진하고, 파골세포 의 생존을 증진시켜 병적인 골흡수 증가를 유발할 수 있다고 보고하고 있다16). 따라서, 본 연구에서는 골모세포와 파골세포 의 활성이 상호 연결되어 있다는 사실과 Ninjurin1에 의해 파골 세포의 분화가 촉진된다는 최근 보고에 근거하여, Ninjurin1이 골모세포의 분화에 미치는 영향에 대해 분석하였다.

    본 연구에서는 마우스 장골 조직을 대상으로 Ninjurin1의 발현 여부를 면역염색법으로 확인하였으며, 세 가지 종류의 osteogenic cell 을 사용하여 (mouse calvarial pre-osteoblast, C2C12, MC3T3-E1) 골모세포 분화 과정 중 Ninjurin1의 발현 변화를 분석하였다. 흥미롭게도, BMP2와 같은 골모세포 분화 유도 인자 (osteogenic stimulus)가 존재하지 않는 상황에서도 세포를 오래 배양하면 Ninjurin1의 발현이 증가하는 것을 확인 하였으며, 이와 같은 cell density 상승으로 유발되는 Ninjurin1의 발현 증가는 HeLa와 A549와 같은 암세포에서도 동일하게 관찰 된다는 사실을 발견하였다. 더불어, Ninjurin1을 knockdown 시 켰을 시, 골모세포의 분화가 억제된다는 사실도 확인하였다.

    Ⅱ. MATERIALS and METHODS

    1. Immunohistochemistry of Ninjurin1

    모든 동물실험은 부산대학교 실험동물윤리위원회의 심의를 받은 후 승인 하에 진행하였다 (PNU-2019-2200). 5주령 암컷 ICR마우스로부터 tibia를 분리하여 4% paraformaldehyde용액 으로 고정한 후, 12% EDTA 용액을 이용하여 3주간 탈회 반응 을 하였다. 탈회가 끝난 조직은 paraffin embedding하였으며, microtome을 이용하여 6 mm 두께의 절편으로 제작하였다 (Leica microtome RM2145; Leica Microsystems). 제작된 조직 절편 슬라이드는 50℃에서30분간 baking한 후, xylene을 이용하여 paraffin을 제거하였으며, 연속된 에탄올 용액 반응을 통해 면 역 염색에 적합한 상태로 rehydration 하였다. 면역 염색의 대 조군으로 rabbit IgG isotype control (ThermoFisher Scientific) 를 사용하였으며, Ninjurin1을 검출하기 위해 Ninjurin1 rabbit polyclonal antibody (ThermoFisher Scientific)를 사용하였다. 항체 반응이 끝난 조직은 DAB peroxidase (HRP) substrate kit (VECTOR laboratories)이용하여 갈색반응으로 Ninjurin1 을 시각화 하였으며, counter staining으로 hematoxylin 염색 을 수행하였다.

    2. Purification of Calvarial Pre-Osteoblast

    마우스 calvarial pre-osteoblast의 분리는 기존 보고한 논문 의 실험법을 준용하여 수행하였다17,18). 요약하자면, 1일령 ICR 마우스의 두개골을 절개하여 취합한 후 0.1% collagenase 와 0.2% dispase를 포함하는 HBSS 용액을 이용하여 15분간 효소 반응시킴으로써 calvarial pre-osteoblast를 획득하였다. 효소 반응은 연속 7회 반복하였으며, fibroblast contamination 이 있을 것으로 예상되는 첫 번째 세포 취합액은 실험에 사용 하지 않았다. 취합된 세포액에 포함된 뼈조직을 제거한 후 calvarial pre-osteoblast를 inline1.gif-MEM 배지에 3일간 배양한 후, 바닥에 부착된 살아있는 세포만을 취합하여 실험에 이용할 때 까지 액체 질소에 냉동보관 하였다.

    3. Osteoblast differentiation

    Mouse primary osteogenic cell인 calvarial pre-osteoblast와 mouse osteogenic cell line인 C2C12 세포와 MC3T3-E1 세포 를 골모세포 분화 실험에 이용하였다. 표준 cell density 실험에 서는 3x104 cells/well (48-well plate) 혹은 2x105 cells/well (6-well plate)의 세포 숫자로 seeding 하였으며, 실험의 필요에 따라 3배 혹은 5배 더 높은 세포 숫자로 seeding 하였다 (Fig. 3). 세 가지 세포 모두 100 ng/ml 농도의 BMP2 (PROSPEC)를 처리하여 골모세포 분화를 유도하였으며, 골모세포의 분화 정 도는 alkaline phosphatase-staining (ALP-staining)으로 확인하 였다. ALP-positive 상태의 골모세포가 형성되기까지, calvarial pre-osteoblast와 C2C12 세포는 4일, MC3T3-E1 세포는 6일이 소요되었다.

    4. RT-PCR (Reverse transcriptase polymerase-chain reaction)

    PCR분석법을 이용하여 세포 내에서 발현하고 있는 mRNA 의 양을 측정하였으며, PCR 분석은 기존에 보고하였던 표준 조건에 준하여 진행하였다19,20). 각 실험 조건에 맞게 배양된 세포를 TRIzol reagent (Invitrogen) 를 이용하여 용해시키고 총 RNA를 추출한 뒤, 이중 1.5 ug의 RNA를 Superscript II (Invitrogen) 로 역전사하여 PCR 반응에 이용할 cDNA를 합성 하였다. 합성된 cDNA 중 1ul를 PCR반응에 이용하였으며, 각 PCR 반응의 reaction cycle은 20~25로 수행하였다. PCR 반응에 사용된 primer sequence는 다음과 같다. Ninjurin1 (forward) 5’-TCTTCATTACGGCCTTCGGG-3’ (reverse) 5’-CCCTTAAAG TCTCTGGGCGTT-3’; Ninjurin2 (forward) 5’-GGAGGGAACC AGCGCATAGA-3’ (reverse) 5’-CTGCATGGTGTGCTCCGAA A-3’; ALP (forward) 5’-CTTGACTGTGGTTACTGCTG-3’ (reverse) 5’-GAGCGTAATCTACCATGGAG-3’; GAPDH (forward) 5’-A GGTCATCCCAGAGCTGAACG-3’ (reverse) 5’-CACCCTGTTG CTGTAGCCGTAT-3’.

    5. Western blotting

    Ninjurin1 단백질과 골모세포 분화 인자인 RUNX2단백질의 세포 내 발현 양을 확인하기 위해 Western blotting 실험을 수행 하였다. 각 실험 조건에 맞게 세포를 배양한 후 cell extraction buffer (50 mM Tris;pH 8.0, 150 mM NaCl. 1.5 mM MgCl2, 1mM EGTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF and complete protease inhibitor cocktail)를 이용하여 세포를 파쇄한 뒤, 총 세포 단백질만을 추출하여 Bradford assay (Bio-Rad)로 단백질 의 농도를 정량 하였다. 각 그룹당 30 ng의 단백질을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하였고, PVDF membrane에 transfer 하여 면 역검출반응에 적절한 형태로 protein band를 제작하였다. Transfer가 완료된 membrane을 5% skim milk에 1시간 반응하 여 blocking 한 후 primary antibody에 해당하는 Ninjurin1 항체 (Santa Cruz Biotechnology)와 RUNX2 항체 (MBL International Corporation) 를 4℃ overnight 반응시킴으로써 면역검출반응을 진행하였다. HRP (horseradish peroxidase) 가 결합된 secondary antibody를 이용하여 2차 면역반응을 수행하였고, chemi-luminescence detection kit (Roche)를 통해 면역반응의 정도를 측정하였다. 모든 Western blotting 실험을 수행할 시, 항존단백질인 Actin을 loading control로 이용하였다.

    6. Ninjurin1 knockdown by siRNA transfection

    Calvarial pre-osteoblasts 세포에서 Ninjurin1단백질의 발현 을 억제하기 위해 siRNA transfection (small-interfering RNA transfection) 기법을 이용하였다. Ninjurin1-specific siRNA oligonucleotide와 control-siRNA nucleotide는 SantaCruz Biotechnology 사의 제품을 이용하였으며, Lipofectamin 2000 (Invitrogen)을 이용하여 free-serum 조건에서 12시간 동안 세포 에 transfection 하였다. Transfection 완료 48시간 후, Ninjurin1 특이적인 gene knockdown은 RT-PCR을 통해 확인하였으며, Ninjurin1 knockdown이 확인된 조건의 세포는 BMP2를 이용 하여 골모세포 분화를 유도하였다.

    Ⅲ. RESULTS

    뼈를 형성하는 골모세포에서 Ninjurin1의 역할을 확인하기 전에, 골조직에서 Ninjurin1이 발현하는지 여부를 immunohistochemistry 기법으로 검증하였다. 5주령 암컷 ICR마우스의 tibia를 분리하 여 파라핀 조직으로 만든 후 Ninjuron1에 대한 항체로 면역 염 색을 수행한 결과, 골표면 및 골수 내 존재하는 다양한 세포군 에서 Ninjurin1이 발현하고 있는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 1a). 흥미롭게도, 골조직 내에 존재하는 혈관에서는 Ninjurin1 의 발현을 일관되게 관찰할 수 있었으나, 골조직 내에 존재하 는 골세포 (osteocyte) 에는 Ninjurin1이 발현하지 않는다는 사실을 관찰할 수 있었다 (Fig. 1b). 또한, 연골 조직이 석회화 된 골조직으로 치환되는 현상이 존재하며, 동시에 골모세포의 활성이 상대적으로 높게 유지되는 growth plate 부근에서 Ninjurin1의 발현이 확연히 증가해 있다는 사실도 확인하였다 (Fig. 1c). 위와 같은 결과를 바탕으로 골조직에 존재하는 세 포에서 Ninjurin1이 발현하고 있다는 사실을 확인할 수 있었 으며, 따라서 골모세포를 대상으로 Ninjurin1의 발현양을 검증 하는 다음 실험을 진행하였다.

    세포 수준에서 Ninjurin1의 발현을 측정하기 위해, primary cell로서 mouse calvarial pre-osteoblast를 사용하였고, cell line으로서 C2C12세포와 MC3T3-E1 세포를 사용하였다. 상기 세 가지 세포에 BMP2 (100 ng/ml)를 처리하여 성숙 골모세포 분화를 유도하였으며, 해당 배양 조건에서 calvarial preosteoblast와 C2C12세포는 4일, MC3T3-E1세포는 6일의 시간 이 경과하면 성숙골모세포로 분화한다는 것을 선행 연구로 확 인하였다. 세 종류의 세포를 골모세포로 분화 시키면서 분화 시기별 cell lysates를 취합하여 Ninjurin1의 발현을 western blot으로 확인한 결과, 세 가지 세포 모두에서 분화가 진행될수 록 Ninjurin1의 발현이 증가한다는 사실을 확인할 수 있었다 (Fig. 2a). 또한, Ninjurin1의 mRNA 발현을 RT-PCR로 확인한 실험에서도 골모세포 분화가 진행될수록 Ninjurin1의 mRNA발 현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 2b). RT-PCR 실험 에서는 골모세포 분화 표지자인 alkaline phosphatase (ALP)의 mRNA레벨도 함께 확인하였으며, 골모세포 분화가 진행될수 록 ALP의 발현이 증가하는 것으로 보아 본 실험의 골모세포 분화 유도는 정상적으로 수행되었음을 재확인하였다 (Fig. 2b). 따라서, 본 결과를 통해 골모세포에서 Ninjurin1이 발현 하는 것을 생화학적으로 확인하였으며, 더불어 Ninjurin1의 발 현은 골모세포 분화가 진행될수록 증가함을 알 수 있었다.

    앞선 Fig. 2의 실험에서는 골모세포 분화 유도 인자인 BMP2가 존재하는 조건에서 2 ~ 4일 경과 후 Ninjurin1의 발현 정도를 단백질과 mRNA 수준에서 확인하였다. BMP2의 존재 여부가 Ninjurin1의 발현에 영향을 미치는지를 확인하기 위해, BMP2가 존재하지 않는 조건에서 2 ~ 4일 동안 세포를 단순히 배양한 후 BMP2가 존재하는 조건과 비교하여 Ninjurin1의 발 현을 western blot으로 측정하였다. 대표적인 primary cell인 calvarial pre-osteoblast와 대표적인 cell line인 C2C12 세포를 이용하여 실험을 진행하였으며, 놀랍게도 BMP2가 존재하지 않는 단순 세포배양 조건에서도 시간이 경과할수록 Ninjurin1 의 단백질 발현이 증가한다는 사실을 관찰할 수 있었다 (Fig. 3a-b). 전사 인자 (transcription factor)의 일종인 RUNX2는 BMP2에 의해 발현이 유도된다고 알려져 있으며, 골모세포 분 화에 결정적인 역할을 한다는 사실이 보고되어 있다21,22). Fig. 3a와 3b의 western blot 결과에서 BMP2를 처리한 그룹에서만 RUNX2 발현이 유도된 것으로 보아, BMP2는 정상적으로 작 용했으며, Ninjurin1은 BMP2가 존재하지 않더라도 세포배양 시간이 경과하면 발현이 높아진다는 사실을 알 수 있었다. 세 포배양 시간이 길어질 경우, 세포는 계속 증식하여 결국 세포 밀도 (cell density)가 높은 환경을 형성하게 된다. 따라서, 추 가적인 외부 자극 물질이 존재하지 않는 조건에서 유일하게 변수로 고려할 수 있는 것은 세포 밀도이므로, calvarial preosteoblast를 다양한 세포 밀도로 seeding하여 24시간 동안 배 양한 뒤, Ninjurin1의 단백질 발현양을 western blot으로 측정 하였다 (Fig. 3c). 그 결과 BMP2 등과 같은 자극 물질이 존재하 지 않는 환경에서 24시간만 세포 배양을 하더라도, Ninjurin1의 발현은 세포 밀도가 높아질수록 증가한다는 사실을 확인할 수 있었다. 이와 같은 세포 밀도 의존적 Ninjurin1의 발현이 골모 세포 계열에서만 나타나는 현상인지 여부를 검증하기 위해, human cervical cancer cell line인 HeLa 세포와 human lung cancer cell line인 A549 세포를 이용하여 세포 밀도 의존적 Ninjurin1의 발현이 관찰되는지 확인하였다 (Fig. 3d). 본 연구 의 가설과 일치하게도 세포 밀도가 높아지면 Ninjurin1의 발현 이 함께 증가한다는 사실을 확인할 수 있었다 (Fig. 3d). 이와 같은 결과를 토대로, Ninjurin1의 발현을 조절하는 중요 인자는 세포 밀도이며, 세포 밀도 의존적 Ninjurin1 발현 조절은 골모 세포계열에만 국한된 것이 아니라, 다른 계열의 세포에서도 존 재한다는 사실을 확인할 수 있었다.

    비록 Ninjurin1의 발현이 골모세포 분화유도인자인 BMP2 에 의해 조절되는 것은 아니지만, 골모세포 분화가 진행될수 록 Ninjurin1 단백질의 발현이 높아지는 것은 명백히 확인하 였으므로 (Fig. 2), Ninjurin1이 골모세포 분화에 기여하는지 여부를 확인하기 위해 Ninjurin1-knockdown 실험을 수행하 였다. 대조군인 control siRNA (small-interfering RNA) 또는 Ninjurin1-specific siRNA oligonucleotide를 calvarial preosteoblast에 transfection하여 knockdown을 유도하였으며, Ninjurin1 특이적으로 knockdown에 성공하였다는 사실은 RT-PCR을 통해 확인하였다 (Fig 4a). 이러한 방법으로 획득한 Ninjurin1-knockdown 세포에 BMP2 를 처리하여 골모세포 분화를 유도하였으며, 흥미롭게도 Ninjurin1-knockdown 세 포는 control-knockdown 세포에 비해 골모세포 분화가 감소 한다는 사실을 ALP staining과 ALP mRNA 발현을 측정하는 RT-PCR로 확인하였다 (Fig. 4b-c). 따라서, Ninjurin1의 발현 은 BMP2와 같은 osteogenic stimulus에 의해 조절되는 것은 아니지만, 골모세포 분화가 진행될수록 Ninjurin1의 발현이 증 가하며, 증가된 Ninjurin1은 골모세포 분화에 기여하고 있다는 결론은 내릴 수 있었다.

    Ⅳ. DISCUSSION

    Ninjurin1은 말초신경계 손상 시 발현이 증가하여 axonal growth를 유도하는 세포막 단백질로 최초 발견된 이후1,2), 혈관 계와 중추신경계에서 발현도 확인되었으며23), 현재는 epithelial origin의 거의 모든 조직에서 발현하는 것으로 알려져 있다23). Ninjurin1은 하나의 adhesion motif와 두 개의 transmembrane domain을 가지고 있으며, adhesion motif를 통해 hemophilic 또 는 heterophilic interaction을 함으로써, 세포간 부착을 일으킬 수 있고, 혈관을 포함한 여러 조직에서 leukocyte의 phagocytosis, inflammation, tissue regeneration 등을 조절할 수 있는 것으 로 보고된 바 있다24,25). 염증반응은 기본적으로 상이한 세포 간 긴밀한 접촉을 통해 개시/유지될 수 있으므로, 염증반응에서 중 요한 역할을 하고 있는 myeloid 계열의 세포인 monocyte, macrophage, microglia 등의 세포를 중심으로 Ninjurin1의 역 할이 연구되고 있다26-28). 반면에 Ninjurin1과 50%의 구조적 유사성을 갖고 있는 Ninjurin2의 경우 그 발현이 adult bone marrow와 enteric neuron 등으로 제한적이므로 현재까지 큰 주목을 받지 못하고 있다29).

    Ninjurin1이 bone metabolism에 미치는 영향에 대한 연구 는 전무한 상황이었으나, osteoclast가 macrophage로부터 분 화되고, macrophage를 포함하는 myeloid 계열의 세포에서 Ninjurin1이 다양한 역할을 하고 있다는 사실에 근거하여, 골 관련 연구에서는 최초로 Ninjurin1이 osteoclast 분화를 조절 할 수 있다는 내용이 2019년 발표된 바 있다16). 해당 논문에서 는 Ninjurin1의 활성 억제 시, osteoclast분화 자체는 영향을 받지 않지만, pre-osteoclast의 세포자멸사 (apoptosis)가 촉진 되어 전반적인 osteoclast의 골흡수능이 저하되고, 이러한 골 흡수능 저하로 인해 Ninjurin1-knockout 마우스는 비정상적으 로 증가한 bone volume을 갖게 된다고 보고하고 있다. 상기 와 같이 osteoclast의 생존과 활성에 Ninjurin1이 작용한다는 사실은 알려졌으나, 골 항상성은 osteoclast와 osteoblast에 의 한 균형 잡힌 골흡수와 골형성에 의해 유지되므로, 본 연구에 서는 osteoblast를 대상으로 Ninjurin1의 역할을 분석하였다. 본 연구를 통해 Ninjurin1의 발현은 osteoblast 분화가 진행될 수록 증가하며 (Fig. 2), 이러한 현상은 BMP2와 같은 분화유 도인자와 관련없이 세포 밀도의 증가로 인해 기인하고 (Fig. 3), Ninjurin1의 발현을 억제하면 osteoblast의 분화가 감소된 다는 사실을 확인하였다 (Fig. 4). 기존 연구와 본 연구를 함께 비교할 때 주목할 만한 사실을 발견할 수 있는데, 바로 Ninjurin1의 발현을 억제하면 파골세포의 생존이 감소하여 골 흡수가 저해될 뿐만 아니라16), 골모세포의 분화도 감소하여 골형성이 저해될 수 있다는 점이다 (Fig. 4).

    본 연구에서는 Ninjurin1의 발현을 유도할 수 있는 주된 자 극이 cell density인 것으로 관찰되었다. 세포증식으로 인해 cell density가 증가하면 Ninjurin1의 발현이 증가하는 현상은 비단 골모세포계열에서뿐만 아니라, human cervical cancer cell과 human lung cancer cell에서도 관찰된 것으로 보아 (Fig. 3), 세포 밀도 의존적 Ninjurin1의 발현은 다양한 종류의 세포에 존재하는 일반적인 기전일 가능성이 있다. 세포 밀도 의 존적으로 단백질 발현이 증가하는 현상은 흔한 사례는 아니지 만, Ninjurin1에만 국한된 현상은 아니며 그 대표적 유사한 예로 EDG family receptor (endothelial differentiation gene family receptor)의 발현을 들 수 있다30,31). EDG family receptor는 lysophosphatidic acid (LPA)의 수용체로서, 세포 밀도가 증가 할수록 혈관사이세포 (mesangial cell)에서 발현이 증가한다는 사실이 잘 알려져 있다30). 또한, 근원세포 (myoblast)의 활성을 조절하는 세포 내 신호전달 단백질인 stathmin 역시 세포 밀도 가 증가할수록 myoblast에서 발현이 증가하는 것으로 보고되 어 있다 32,33). 근원세포 (Myoblast)는 일정 수준이상의 세포 밀도가 되면 규칙적으로 정렬하면서 근관세포 (myotube)로 분 화한다고 알려져 있다33). 위 두 가지 예, 즉 EDG family receptor와 stathmin의 발현에서 중요한 공통점을 찾을 수 있 는데, 바로 생리학적으로 세포 밀도 변화가 요구되는 상황에서 EDG family receptor 혹은 stathmin의 발현이 조절된다는 사실 이다. Mesangial cell은 신장 사구체 (kidney glomerulus)의 기 능을 적절히 유지하기 위해 cell density의 조절을 필요로 하고, myoblast는 일정 수준 이상의 높은 세포 밀도가 되어야 비로서 myotube로 분화가 진행될 수 있다. 앞선 연구에서 Ninjurin1의 발현 증가가 관찰된 상황은 다양한 종류의 면역세포 침투를 수반하는 자가면역 뇌질환26), 혹은 LPS (lipopolysaccharide)에 의해 유도되는 염증 반응 등이었다25,28). 상기 두 가지 조건 모두 세포 밀도의 증가를 필수적으로 요구하는 상황이므로, 세포 밀도 의존적 Ninjurin1의 발현은 생리학적으로 의미가 있다고 예측할 수 있다. 또한, 골모세포 분화의 경우도 마찬가 지로, 미성숙 전구 골모세포의 증식을 통해 충분한 세포 밀도 가 확보된 이후 본격적인 분화 신호가 전달된다고 잘 알려져 있다34,35). 골모세포 분화가 진행될 때, 인접 전구 골모세포 간 Gap-junction을 통해 동기화되어 마치 하나의 세포처럼 행동한 다는 사실은 (synchronized osteoblast differentiation) 골모세 포 분화에서 cell adhesion이 얼마나 중요한지를 시사해준다 36,37). 따라서, Ninjurin1을 포함한 세포 부착 분자들은 골모세포 분화에서 더욱 중요한 기능을 수행하고 있으므로, Ninjurin1- knockdwon 조건에서 골모세포 분화가 저해되었다는 본 연구 의 결과는 (Fig. 4) 생리학적으로 타당한 의미가 있을 것으로 사료된다. 요약하자면, 본 연구를 통해 Ninjurin1이 골모세포 에 존재한다는 것을 확인하였으며, Ninjurin1의 발현은 BMP2 와 같은 골모세포 분화 유도물질의 존재여부와 관련없이 세포 밀도의 증가에 의해 촉진되었고, Ninjurin1의 발현을 억제하면 골모세포 분화가 감소된다는 사실을 알 수 있었다.

    ACKNOWLEDGEMENTS

    이 논문은 부산대학교 기본연구지원사업(2년)에 의하여 연 구되었음

    Figure

    KAOMP-43-5-147_F3.gif

    Ninjurin1 expression was regulated by cell density regardless of osteogenic stimulus. (a and b)

    Mouse calvarial pre-osteoblast and C2C12 cells were cultured in the absence or presence of BMP2 (100 ng/ml) for up to 4 days. The protein expressions of Ninjurin1 as well as the master osteogenic transcription factor, RUNX2 were examined by Western blotting. (c) Mouse calvarial pre-osteoblasts were seeded at various densities (x1, 2x105/well; x3, 6x105/well; x9, 1.8x106/well) without BMP2. After 24 h of culture, total cell lysates were subjected to Western blotting to examine the expression of Ninjurin1. (d) Human cervical cancer cell line, HeLa and human adenocarcinoma cell line, A549 cells were plated at densities with difference of five times (x1, 2x105/well; x5, 1x106/well) and cultured for 24h. After the culture, the protein expression levels of Ninjurin1 were assessed by Western blotting.

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    The expression of Ninjurin1 protein in bone tissues. (a)

    The Ninjurin1 protein expression was evaluated by immunostaining of mouse tibia sections with anti-Ninjurin1 antibody (dyed brown color). The isotype-matched rabbit IgG served as a negative control of staining (x200 magnification). (b) The stained bone matrix tissue images were shown at x1000 magnification. (c) The Ninjurin1 stained images were focused on distal growth plate of tibiae and shown at three different magnifications (x200, x400, and x1000).

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    Ninjurin1 expression was increased during osteoblast differentiation. (a)

    The three kinds of osteogenic cells (mouse primary calvarial pre-osteoblast, mouse myoblast cell line C2C12, and mouse osteoblastic cell line MC3T3-E1) were culture in a-MEM medium containing BMP2 (100 ng/ml) and allowed to differentiate into osteoblast for indicated days. The protein expression levels of Ninjurin1 were determined by Western blotting. Actin served as an internal loading control. (b) Cells were cultured as in (a), and the mRNA expressions of Ninjurin1 were analyzed by RT-PCR. ALP was used as an osteoblast marker gene and GAPDH was used as a loading control.

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    The knockdown of Ninjurin1 reduced osteoblast differentiation. (a)

    Calvarial pre-osteoblasts were transfected with control siRNA oligonucleotides (control-si) or Ninjurin1 specific siRNA oligonucleotides (Ninjurin1-si) and cultured for 48 h. The isotype specific knockdown of Ninjurin1 was evaluated by RT-PCR. (b) The control or Ninjurin1-knockdowned cells were further cultured in the presence of BMP2 (100 ng/ml) for 4 days and the osteoblast differentiation was examined by ALP staining. (c) Cells were cultured as in (b) and the ALP mRNA expression was analyzed by RT-PCR.

    Table

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