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ISSN : 1225-1577(Print)
ISSN : 2384-0900(Online)
The Korean Journal of Oral and Maxillofacial Pathology Vol.42 No.6 pp.159-165
DOI : https://doi.org/10.17779/KAOMP.2018.42.6.001

Osteoporotic Bone Phenotype in Mats1/2 Double-Mutant Mice

Juhwan Oh1), YunJeong Choi1),2), Mi Heon Ryu3), Moon-Kyoung Bae1),2), Hyung Joon Kim1),2)*
1)Department of Oral Physiology
2)BK21 PLUS Project
3)Department of Oral Pathology School of Dentistry, Pusan National University
Correspondence: Hyung Joon Kim, Department of Oral Physiology, School of Dentistry, Pusan National University Tel: +82-51-510-8278, Fax: 82-51-510-8238 E-mail: hjoonkim@pusan.ac.kr
November 27, 2018 November 30, 2018 December 14, 2018

Abstract


The Hippo pathway was originally discovered in Drosophila by genetic screening and it has been shown to be conserved in various organisms including human. Until now, the essential roles of Hippo pathway in regulating cell proliferation, apoptosis, tumorigenesis, and organ size control is extensively studied. Currently, Mats1/2 (Mob1a/1b), one of the important components in Hippo pathway, mutant mice were generated which has abnormal phenotype such as resistance to apoptosis and spontaneous tumorigenesis. Of note, Mats1/2 mutant mice also showed dental malocclusion. Therefore, in this study, we have evaluated the bone phenotype of Mats1/2 mutant mice. Although the mRNA expressions of Mats1 or Mats2 were observed in both osteoclastogenesis and osteoblastogenesis, the increase of Mats1 level was most prominent during osteoblastogenesis. The RANKL-induced osteoclast differentiation from bone marrow-derived macrophages (BMMs) was unaltered upon Mats1/2 mutation; however, the osteoblast differentiation using calvarial pre-osteoblasts was significantly reduced in Mats1/2 mutant mice compare to that of wild type mice. In accordance with in vitro results, Mats1/2 mutant mice showed decreased bone volume as well as increased trabecular separation in μCT analyses. These results may provide novel prospect of the probable linkage between Hippo pathway and bone homeostasis.



Mats1과 Mats2 이중결손 유전자 돌연변이에 의한 골감소증 기전에 대한 연구

오 주환1), 최 윤정1),2), 유 미현3), 배 문경1),2), 김 형준1),2)*
1)부산대학교 치의학전문대학원 구강생리학교실
2)BK21플러스 사업단
3)구강병리학교실

초록


    Pusan National University

    Ⅰ. 서 론

    Hippo pathway는 약 20여년 전 초파리에서 처음 발견된 이후 포유류를 비롯한 여러 생물체에 존재하는 것이 확인되었으며, 그 동안 보고된 결과를 종합해보면, 세포증식과 사멸을 조절하는 기 본 기전을 바탕으로 생체 내 기관의 크기 조절 및 암의 형성에 Hippo pathway가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다1,2). Hippo pathway는 30여개 이상의 다양한 component molecule 이 관여하는 일련의kinase cascade가 주축을 이루고 있으며, 관 련된 component molecule의 기능은 serine/threonine인산화효 소, transcription factor, transcription coactivator 등으로 다양하 다3,4). 사람과 같은 포유류의 경우 Hippo pathway를 구성하 는 요소는 매우 다양하게 존재하나 그 핵심요소는 Mst1/2 (mammalian Ste20-like 1/2), Lats1/2 (large tumor suppressor 1/2), Mob1 (mps one binder1) 그리고 Mats1/2 (mob as tumor suppressor)에 의해 전달되는 연쇄 인산화 반응으로 인 한 Yap (yes-associated)과 Taz (transcriptional co-activator with PDZ-binding motif) 등의 보조전사인자 활성화로 요약할 수 있다5,6). Hippo pathway연구 초기 단계에서는 발생과정에 서 기관의 크기를 결정하는 것이 주된 역할인 것으로 인식되었 으나, 현재는 암의 발생과 전이에 Hippo pathway가 중요한 기 능을 하는 것으로 밝혀지면서 다수의 종양 연구자들이 새로운 암발생/암전이 관련 타겟을 찾기 위해 Hippo pathway에 대해 연구를 진행하고 있다7,8). 특히 사람의 여러 암종에서 Mats1 (Mob1a)과 Mats2 (Mob1b)가 불활성화 되어 있다는 사실을 바 탕으로, 2012년 일본의 Akira Suzuki 그룹은 keratinocyte 특이 적 Mats1/2 이중결손 돌연변이 마우스를 제작하였다. Mats1/2 이중결손 돌연변이 마우스는 Mats1/2의 이배체 모두 결손 되었 을 시 배아상태로 사망하였으며, Mats1/2를 일배체 상태로 결 손 시켰을 시 정상 마우스에 비해 높은 피부암 발병률이 관찰되 었고 더불어 영양 물질 대사에 장애가 발생하여 수명이 짧아지 는 표현형을 나타내었다9). 이러한 사실은 Hippo pathway의 핵 심 구성인자인 Mats1/2가 발생단계에서 중요한 역할을 하고 있 음을 시사해줄 뿐만 아니라, 암의 형성과 nutrient metabolism 에도 기능을 하고 있음을 보여준다고 할 수 있다.

    Mats1/2 돌연변이 마우스는 암 발병률이 높고, 영양물질 대 사에 장애가 있을 뿐만 아니라 경조직에 독특한 side-effect을 가진 것으로 확인되었다. 즉, femoral head에 비정상적인 bone 이 형성되어 있었으며, 심각한 dental malocclusion으로 인해 저작 기능을 거의 상실하였다9). 개체의 골항상성과 치아발생 은 깊은 상호작용을 갖고 있다는 사실에 근거하여 Mats1/2 돌 연변이 마우스는 비정상적인bone metabolism를 갖고 있을 것이라는 추론이 가능하였으며, 본 연구는 이에 근거하여 시 작하게 되었다.

    본 연구에서는 microCT분석을 통해 Mats1/2 돌연변이 마우 스의 장골bone volume이 크게 감소하여 있다는 사실을 확인 하였으며, 해당 마우스의 골수유래 대식세포 (BMMs, bone marrow-derived macrophages)를 추출하여 파골세포로 분화 시켜 본 결과 정상 마우스와 큰 차이가 없다는 사실을 발견하 였다. 또한 정상마우스와 Mats1/2 돌연변이 마우스의 calvarial pre-osteoblast를 분리하여 조골세포 분화능을 비교분석 하였 으며, 그 결과 Mats1/2 돌연변이 마우스는 정상 마우스에 비 해 조골세포 분화능이 현저히 저하되어 있다는 사실을 확인하 였다.

    Ⅱ. 재료 및 방법

    1. Mats1/2 mutant mice and in vitro osteoclast differentiation

    Mats1/2 mutant mice는 국립암센터 이호교수에게 제공받 아 실험을 진행하였다. Mats1-/-Mats2-/- mouse는 embryonic lethality를 보이므로, 본 실험에서는 Mats1+/-Mats2-/- 마우스를 이용하였다. 5주령 수컷 wild-type 혹은 Mats1/2 mutant 마우 스의 골수로부터 bone marrow cell을 분리한 후, ACK buffer 에 반응시켜 적혈구를 파쇄하였고, alpha-MEM 배지를 이용하 여 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 바닥에 부착된 세포를 제거하고 상층 부유 세포만 취합하여 M-CSF (30 ng/ml)가 존재하는 alpha-MEM 배지에 3일간 추가 배양함으로써 전구 파골세포로 사용할 대식세포 (BMMs, bone marrow-derived macrophages)를 확보하였다. 획득한BMMs은 파골세포 분화유도배지 (M-CSF 30 ng/ml + RANKL 100 ng/ml, alpha-MEM)에 4일간 배양할 시 성숙한 파골세포로 분화하는 것을 확인하였다. 성숙 파골세포 분화는 tartrate-resistance acid phosphatase (TRAP) 염색을 통해 확 인하였으며, 핵이 4개 이상인 TRAP-positive 세포를 파골세포 로 간주하였다.

    2. Calvarial pre-osteoblast purification and osteogenic differentiation

    1일령 (1-day mouse) wild-type 혹은 Mats1/2 이중결손 돌연변 이 마우스의 두개골을 절개 취합한 후 0.1% collagenase와 0.2% dispase에 15분간 반응시킴으로써 calvarial pre-osteoblast를 획득 하였다. 이 과정은 7회 반복하였으며, fibroblast contamination이 있을 것으로 예상되는 초기 두 번의 세포 취합액은 실험에 사용하 지 않았다. 획득한 세포를 osteogenic medium (50 μM L-ascorbic acid + 10 mM beta-glycerophosphate)에 배양함으로써 조골세 포 분화를 유도하였으며, 약 6일후 ALP염색을 통해 조골세포 분화 정도를 비교하였다.

    3. Reverse transcriptase polymerase-chain reaction (RT-PCR) and quantitative real-time PCR

    세포 내 mRNA발현양을 측정하기 위한 PCR분석은 일반적 인 조건에 준하여 수행하였다. 총 RNA를 TRIzol reagent로 추 출한 뒤, 2 ug의 RNA를 정량하여 Superscrpit II로 역전사하여 cDNA를 합성하였다. RT-PCR실험의 경우 합성된 cDNA중 1ul 를 PCR반응에 이용하였으며, real-time PCR의 경우 SYBR master mix를 이용하여 cDNA를 정량적으로 증폭하였다. 실험 에 사용된 primer sequence는 다음과 같다. Mats1 (forward) 5’-ACCACTGGGCAGATGGCACT-3’ (reverse) 5’- AGTGGTG CCAACTCACGCCT-3’; Mats2 (forward) 5’- AAGCATGCGGA AGCCACACT-3’ (reverse) 5’- TCTTCGGGAATGGAACACCA A-3’; Runx2 (forward) 5’-CGC ACG ACA ACC GCA CCA-3’ (reverse) 5’- CAG CAC GGA GCA CAG GAA GTT-3’; Actin (forward) 5’- CGATGCCCTGAGGCTCTTTT-3’ (reverse) 5’- GGGCCGGACTCATCGTACTC-3’.

    4. Western blot

    Wild-type mouse와 Mats1/2 mutant mouse로부터 BMMs 세포 를 분리하여 M-CSF (30ng/ml)와 RANKL (100 ng/ml)을 48시간동 안 처리하여 파골세포 분화를 유도하였다. 배양된 세포는 Lysis buffer (50 mM Tris;pH 8.0, 150 mM NaCl. 1.5 mM MgCl2, 1mM EGTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF and complete protease inhibitor cocktail)를 이용하여 파쇄한 후, 단백질을 추출하여 Bradford assay (Bio-Rad)로 단백질 정량을 수행하였다. 각 실험군 당 40 ng의 단백질을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하였고, PVDF membrane에 transfer 하였다. 5% skim milk에 1시간 반응하여 blocking 한 후 primary antibody (anti-NFATc1 or c-Fos, Santa Cruz Biotechnology)를 4℃ overnight 반응하였다. HRP가 결합 된 secondary antibody를 이용하여 면역반응을 검출하였고, chemi-luminescence detection kit (Roche)를 통해 측정하였다.

    5. Statistical analysis

    연구결과의 통계분석을 위해 평균과 standard deviation 값 을 구한 후 t-test를 통해 유의성을 검증하였다. 통계적 유의성 평가를 위한 유의 수준은 0.01로 하였다 (**p<0.01).

    Ⅲ. 결 과

    Mats1/2가 bone homeostasis에 미치는 영향을 분석하기 위 하여, 대조군에 해당하는 wild-type마우스와 실험군에 해당하 는 다양한 Mats1/2 mutant마우스를 성별과 주령을 맞추어 준 비하였다. Mats1과 Mats2 두 가지 유전자가 모두 결손된 Mats1-/-Mats2-/- 마우스는 배아단계에서 사망하여 분석이 불가 능하였으나, Mats1과 Mats2 유전자 중 한 가지라도 보유하고 있으면 생존이 가능하다는 사실에 착안하여, Mats1+/-Mats2-/- 마우스를 가장 Mats1/2가 많이 결손된 마우스로 간주하여 분 석하였다. 따라서, 분석에 사용된 마우스의 유전자 타입을 모 두 열거하자면, Mats1+/+Mats2+/+ (Genotype I), Mats1+/+Mats2+/- (Genotype II), Mats1+/+Mats2-/- (Genotype III), Mats1+/-Mats2-/- (Genotype IV)와 같다. 위 열거된 유전자형의 5주령 수컷 마 우스로부터 femur를 분리하여 μCT분석을 수행하였다. 그 결 과 cortical bone thickness는 모든 마우스에서 유사하였으나, growth plate아래 존재하는 trabecular bone volume은 Mats1/2 가 결손된 마우스에서 유의하게 감소하여 있다는 사실을 발견 하였다 (Fig. 1a). 특히, 동일하게 Mats2가 모두 결손된 마우스 (typeIII와 type IV) 라 할지라도 Mats1유전자가 모두 존재하 면 wild-type 마우스와 표현형이 유사하지만, Mats2가 모두 결손된 조건에서 Mats1유전자를 single copy라도 보유하고 있 으면 bone volume이 감소한다는 사실을 확인하였다 (Fig. 1b). Bone quality를 나타내는 또 다른 parameter인 trabecular separation 역시 bone volume이 감소한 type IV마우스 (Mats1+/- Mats2-/-)에서 유의하게 증가하는 것으로 관찰되었다 (Fig. 1c).

    Mats1/2이중결손 돌연변이 마우스에서 골량이 감소한다는 상기 연구 결과는, 골항상성을 유지하는 파골세포 또는 조골 세포의 활성에 Mats1/2가 관련되어 있다는 사실을 시사해주 므로, 파골세포와 조골세포 분화 시기별 Mats1/2의 발현양을 quantitative real-time PCR기법을 통해 확인하였다. 정상 마우 스의 골수로부터 골수유래 대식세포 (BMMs, bone marrowderived macrophage)를 분리하여 전구 파골세포로 이용하였 고, 1일령 정상 마우스의 두개골에서 calvarial pre-osteoblast 를 분리하여 전구 조골세포로 이용하여 분화실험을 진행하였 다. 그 결과, 파골세포 분화의 경우 Mats1와 Mats2의 레벨은 분화가 진행되면서 점차적으로 증가하는 패턴을 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었고, Mats1의 발현양이 분화 시기 전체 에서 Mats2보다 높다는 사실도 관찰하였다 (Fig. 2a). 조골세 포 분화의 경우, 파골세포 분화와 마찬가지로 Mats1과 Mats2 가 분화가 진행될수록 증가하는 패턴을 나타내고 있었으나, Mats1의 증가 폭이 Mats2의 증가 폭보다 월등히 높다는 결과 를 확인할 수 있었다 (Fig. 2b).

    파골세포 분화 과정 중 Mats1/2가 증가한다는 사실을 바탕으 로 Mats1/2돌연변이 마우스의 파골세포 분화가 정상과 비교하여 차이가 있는지 분석하였다. Wild-type 마우스 (type I)와 Mats1/2 mutant 마우스 (type II, III, IV)의 BMMs를 분리하여 RANKL로 파골세포 분화를 유도한 결과 각 유전자형별 파골세포 분화는 큰 차이가 없다는 사실을 관찰하였다 (Fig. 3a-b). 전사인자인 NFATc1 (nuclear factor of activated T-cell)과 c-Fos는 가장 핵심 적인 파골세포 분화유도 인자로 잘 알려져 있다10,11). 파골세포 분화 과정 중, 정상 BMMs과 Mats1/2 돌연변이 BMMs에서 발현 하는 NFATc1과 c-Fos의 단백질량을 western blot으로 확인할 결과, 유전자형 별 파골세포 분화는 큰 차이가 없었다는 TRAP 염색결과와 일치하게도 NFATc1과 c-Fos의 발현양은 Mats1/2 유전자와 관련 없다는 사실을 재확인할 수 있었다 (Fig. 3c).

    골항상성은 파골세포와 조골세포의 활성에 의해 조절되고, 또한 상기 결과에서 파골세포 분화는 Mats1/2유전자와 관련 성이 없는 것으로 관찰되었으므로, 조골세포 분화가 Mats1/2 유전자 결손에 의해 영향을 받는지 분석하였다. 정상 마우스 (type I)와 Mats1/2 이중결손 돌연변이 마우스 (type II, III, IV)의 두개골에서 전구 조골세포를 분리하여 조골세포 분화를 유도하였다. ALP염색으로 조골세포 분화 정도를 비교하였을 때, type IV (Mats1+/-Mats2-/-) 마우스의 조골세포 분화는 여타 마우스의 세포에 비해 조골세포 분화가 크게 저하되어 있다는 사실을 확인하였다 (Fig. 4a). 조골세포 분화를 결정하는 중요 한 전사인자는 Runx2인 점에 근거하여12,13) Runx2의 발현양을 RT-PCR로 확인한 결과 세포 분화 실험 결과와 일치하게도 Mats1+/-Mats2-/-마우스에서 그 발현양이 감소되어 있다는 사실 을 발견하였다 (Fig. 4b).

    Ⅳ. 고찰

    사람과 같은 다세포동물에서 인체 내 각 기관의 적절한 크기 는 기관을 구성하는 세포의 증식, 분열, 사멸에 의해 정교하게 조절된다. 약 20여년 전 초파리의 genetic screening에 의해 발 견된 Hippo pathway는 이러한 기관의 크기를 결정하는 주 신호 경로로 처음 알려졌으며, 그 후 여러 연구진의 성과에 의해 기관 의 크기를 결정할 뿐만 아니라, 암의 형성과 전이, 면역반응에도 관련된 것으로 보고되어 왔다1,2). Hippo pathway는 30개 이상 의 관련 signaling molecule에 의해 전달된다고 알려진 바 있으 며, 그 중 중요한 역할을 담당하는 인자는 Mst1/2 (mammalian Ste20-like 1/2), Lats1/2 (large tumor suppressor 1/2), Mob1 (mps one binder1) 그리고 Mats1/2 (mob as tumor suppressor) 이고, 이러한 signaling cascade는 궁극적으로 transcription factor Yap (yes-associated)과 Taz (transcriptional co-activator with PDZ-binding motif)의 활성을 조절하여 효과를 나타낸다 고 알려져 있다3,4). 위 중요 인자 중 최근 Mats1/2 이중결손 돌연 변이 마우스가 일본 연구팀에 의해 제작되었으며, 해당 마우스는 증가된 암발생률과 저하된 영양물질 대사를 나타냄으로써, Hippo pathway가 암세포 신호전달에 관련되어 있을 뿐만 아니 라, 생체 내 metabolism에도 관련되어 있음을 시사해 주었다9). 본 연구팀은 Mats1/2 이중결손 돌연변이 마우스가 보유하고 있 는 side-effect중 견치의 비정상적인 성장으로 인한 부정교합이 골대사 관련 이상증세를 반영하고 있다고 판단하고 Mats1/2 돌 연변이 마우스의 bone quality를 분석하였다. Mats1+/+Mats2+/+ (Genotype I), Mats1+/+Mats2+/- (Genotype II), Mats1+/+Mats2-/- (Genotype III)는 모두 정상에 가까운 bone phenotype을 보여 주었는데 이들 중 Mats1++-Mats2-/- (Genotype III) 마우스는 Mats2유전자가 전혀 존재하지 않음에도 불구하고, 정상 표현 형을 나타내었다. 이와 같은 사실은 Mats1과 Mats2의 기능이 상호보완적임을 시사해준다고 할 수 있다. 하지만, Mats1/2 이중결손 돌연변이 마우스는 견치가 비정상적으로 성장한 독특 한 형태의 부정교합을 가지고 있고 이로 인한 저작기능 저하로 영양물질 섭취가 부족하여 골량이 감소하였을 가능성을 배제할 수 없다. 그러나, 골량뿐만 아니라, 파골세포 분화와 조골세포 분화도 Mats1+/+Mats2-/-마우스의 세포는 정상적이었으므로, 세 포수준에서도 Mats1과 Mats2의 기능은 상보적이라고 말할 수 있고, Mats1+/-Mats2-/- 마우스에서 관찰되는 골량의 감소는 생체 대사 수준이 아닌 세포수준의 기전으로 해석할 수 있다.

    Taz (transcriptional co-activator with PDZ-binding motif) 는 복잡한 Hippo pathway가 최종적으로 수렴하여 조절하게 되는 transcription factor이다. 흥미롭게도, Taz는 Runx2의 활 성을 조절하여 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell)의 지방세포로의 분화를 억제하고 조골세포로의 분화를 억제한 다고 보고된 바 있다14,15). Taz는 지방세포 분화에 필수적인 전사인자인 PPAR-gamma와 직접 결합하여 그 활성을 억제하 고 반면에, 조골세포 분화에 필수적인 전사인자인 Runx2와 직접 결합하여 그 활성을 촉진할 수 있다는 것이 밝혀졌다15). 따라서, Taz의 상위에 존재하는 Hippo pathway 구성인자인 Mats1/2가 조골세포 활성에 작용할 수 있다는 본 연구결과는 Hippo pathway와 bone metabolism을 연결할 수 있는 또 하 나의 증거로 의미를 찾을 수 있다.

    ACKNOWLEDGEMENTS

    이 논문은 부산대학교 기본연구지원사업(2년)에 의하여 연 구되었음

    Figure

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    Mats1/2-mutant mice show an osteopenic bone phenotype.

    (a) Femurs of 5-week old mats1 or mats2 mutant mice were examined by μCT analyses compared to that of wild-type mice (mats1+/+ mats2+/+). The 3D reconstruction images were obtained and representative images were shown with blue (cortical bone) and white (trabecular bone). (b and c) The bone parameters were quantified by μCT volume software and shown as a graph (BV/TV, bone volume per tissue volume; Tb.Sp, trabecular separation). Data are means ±SD (n=4; **, p < 0.01).

    KOAMP-42-159_F2.gif
    The mRNA expression levels of mats1 or mats2 were most significantly increased during osteoblast differentiation.

    (a) Mouse bone marrow-derived macrophages (BMMs) were cultured in osteoclastogenic medium (30 ng/ml M-CSF plus 100 ng/ml RANKL) for indicated days. After the culture, the mRNA expression levels of mats1 or mats2 were determined by quantitative real time-PCR. (b) Mouse calvarial pre-osteoblasts were purified and allowed to differentiate into mature osteoblasts with osteogenic medium (50 μg/ml ascorbic acid plus 10 mM -glycerophosphate) for indicated days. At the end of culture, mats1 or mats2 mRNA expressions were evaluated by quantitative real time-PCR. Data are means ± SD, three independent experiments (**, p < 0.01).

    KOAMP-42-159_F3.gif
    The mats1/2 deficiency did not affect the RANKL-induced osteoclast differentiation.

    (a and b) BMMs were isolated from mats1/mats2 mutant mice or corresponding wild-type mice and differentiated into osteoclast with RANKL (100 ng/ml) for 4 days. After the culture, cells were stained for TRAP activity and the numbers of TRAP-positive multinucleated cells were quantified. (c) Wild-type or mats1/2 mutant BMMs were cultured in osteoclastogenic medium for 72 hours. The protein expression levels of c-Fos and NFATc1 were examined by western blotting.

    KOAMP-42-159_F4.gif
    Mats1+/-Mats2-/- calvarial pre-osteoblasts possess reduced activity for osteoblastogenesis.

    (a) Calvarial pre-osteoblasts were purified from wild-type or mats1/2 mutant mice and cultured in the osteogenic medium (50 μg/ml ascorbic acid plus 10 mM b-glycerophosphate) for 6 days. Osteoblastic differentiation was assessed by ALP staining. (b) The calvarial pre-osteoblasts were cultured as in (a) for 3 days and the mRNA expression for Runx2 was examined by RT-PCR.

    Table

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