Ⅰ. 서 론
Hippo pathway는 약 20여년 전 초파리에서 처음 발견된 이후 포유류를 비롯한 여러 생물체에 존재하는 것이 확인되었으며, 그 동안 보고된 결과를 종합해보면, 세포증식과 사멸을 조절하는 기 본 기전을 바탕으로 생체 내 기관의 크기 조절 및 암의 형성에 Hippo pathway가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다1,2). Hippo pathway는 30여개 이상의 다양한 component molecule 이 관여하는 일련의kinase cascade가 주축을 이루고 있으며, 관 련된 component molecule의 기능은 serine/threonine인산화효 소, transcription factor, transcription coactivator 등으로 다양하 다3,4). 사람과 같은 포유류의 경우 Hippo pathway를 구성하 는 요소는 매우 다양하게 존재하나 그 핵심요소는 Mst1/2 (mammalian Ste20-like 1/2), Lats1/2 (large tumor suppressor 1/2), Mob1 (mps one binder1) 그리고 Mats1/2 (mob as tumor suppressor)에 의해 전달되는 연쇄 인산화 반응으로 인 한 Yap (yes-associated)과 Taz (transcriptional co-activator with PDZ-binding motif) 등의 보조전사인자 활성화로 요약할 수 있다5,6). Hippo pathway연구 초기 단계에서는 발생과정에 서 기관의 크기를 결정하는 것이 주된 역할인 것으로 인식되었 으나, 현재는 암의 발생과 전이에 Hippo pathway가 중요한 기 능을 하는 것으로 밝혀지면서 다수의 종양 연구자들이 새로운 암발생/암전이 관련 타겟을 찾기 위해 Hippo pathway에 대해 연구를 진행하고 있다7,8). 특히 사람의 여러 암종에서 Mats1 (Mob1a)과 Mats2 (Mob1b)가 불활성화 되어 있다는 사실을 바 탕으로, 2012년 일본의 Akira Suzuki 그룹은 keratinocyte 특이 적 Mats1/2 이중결손 돌연변이 마우스를 제작하였다. Mats1/2 이중결손 돌연변이 마우스는 Mats1/2의 이배체 모두 결손 되었 을 시 배아상태로 사망하였으며, Mats1/2를 일배체 상태로 결 손 시켰을 시 정상 마우스에 비해 높은 피부암 발병률이 관찰되 었고 더불어 영양 물질 대사에 장애가 발생하여 수명이 짧아지 는 표현형을 나타내었다9). 이러한 사실은 Hippo pathway의 핵 심 구성인자인 Mats1/2가 발생단계에서 중요한 역할을 하고 있 음을 시사해줄 뿐만 아니라, 암의 형성과 nutrient metabolism 에도 기능을 하고 있음을 보여준다고 할 수 있다.
Mats1/2 돌연변이 마우스는 암 발병률이 높고, 영양물질 대 사에 장애가 있을 뿐만 아니라 경조직에 독특한 side-effect을 가진 것으로 확인되었다. 즉, femoral head에 비정상적인 bone 이 형성되어 있었으며, 심각한 dental malocclusion으로 인해 저작 기능을 거의 상실하였다9). 개체의 골항상성과 치아발생 은 깊은 상호작용을 갖고 있다는 사실에 근거하여 Mats1/2 돌 연변이 마우스는 비정상적인bone metabolism를 갖고 있을 것이라는 추론이 가능하였으며, 본 연구는 이에 근거하여 시 작하게 되었다.
본 연구에서는 microCT분석을 통해 Mats1/2 돌연변이 마우 스의 장골bone volume이 크게 감소하여 있다는 사실을 확인 하였으며, 해당 마우스의 골수유래 대식세포 (BMMs, bone marrow-derived macrophages)를 추출하여 파골세포로 분화 시켜 본 결과 정상 마우스와 큰 차이가 없다는 사실을 발견하 였다. 또한 정상마우스와 Mats1/2 돌연변이 마우스의 calvarial pre-osteoblast를 분리하여 조골세포 분화능을 비교분석 하였 으며, 그 결과 Mats1/2 돌연변이 마우스는 정상 마우스에 비 해 조골세포 분화능이 현저히 저하되어 있다는 사실을 확인하 였다.
Ⅱ. 재료 및 방법
1. Mats1/2 mutant mice and in vitro osteoclast differentiation
Mats1/2 mutant mice는 국립암센터 이호교수에게 제공받 아 실험을 진행하였다. Mats1-/-Mats2-/- mouse는 embryonic lethality를 보이므로, 본 실험에서는 Mats1+/-Mats2-/- 마우스를 이용하였다. 5주령 수컷 wild-type 혹은 Mats1/2 mutant 마우 스의 골수로부터 bone marrow cell을 분리한 후, ACK buffer 에 반응시켜 적혈구를 파쇄하였고, alpha-MEM 배지를 이용하 여 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 바닥에 부착된 세포를 제거하고 상층 부유 세포만 취합하여 M-CSF (30 ng/ml)가 존재하는 alpha-MEM 배지에 3일간 추가 배양함으로써 전구 파골세포로 사용할 대식세포 (BMMs, bone marrow-derived macrophages)를 확보하였다. 획득한BMMs은 파골세포 분화유도배지 (M-CSF 30 ng/ml + RANKL 100 ng/ml, alpha-MEM)에 4일간 배양할 시 성숙한 파골세포로 분화하는 것을 확인하였다. 성숙 파골세포 분화는 tartrate-resistance acid phosphatase (TRAP) 염색을 통해 확 인하였으며, 핵이 4개 이상인 TRAP-positive 세포를 파골세포 로 간주하였다.
2. Calvarial pre-osteoblast purification and osteogenic differentiation
1일령 (1-day mouse) wild-type 혹은 Mats1/2 이중결손 돌연변 이 마우스의 두개골을 절개 취합한 후 0.1% collagenase와 0.2% dispase에 15분간 반응시킴으로써 calvarial pre-osteoblast를 획득 하였다. 이 과정은 7회 반복하였으며, fibroblast contamination이 있을 것으로 예상되는 초기 두 번의 세포 취합액은 실험에 사용하 지 않았다. 획득한 세포를 osteogenic medium (50 μM L-ascorbic acid + 10 mM beta-glycerophosphate)에 배양함으로써 조골세 포 분화를 유도하였으며, 약 6일후 ALP염색을 통해 조골세포 분화 정도를 비교하였다.
3. Reverse transcriptase polymerase-chain reaction (RT-PCR) and quantitative real-time PCR
세포 내 mRNA발현양을 측정하기 위한 PCR분석은 일반적 인 조건에 준하여 수행하였다. 총 RNA를 TRIzol reagent로 추 출한 뒤, 2 ug의 RNA를 정량하여 Superscrpit II로 역전사하여 cDNA를 합성하였다. RT-PCR실험의 경우 합성된 cDNA중 1ul 를 PCR반응에 이용하였으며, real-time PCR의 경우 SYBR master mix를 이용하여 cDNA를 정량적으로 증폭하였다. 실험 에 사용된 primer sequence는 다음과 같다. Mats1 (forward) 5’-ACCACTGGGCAGATGGCACT-3’ (reverse) 5’- AGTGGTG CCAACTCACGCCT-3’; Mats2 (forward) 5’- AAGCATGCGGA AGCCACACT-3’ (reverse) 5’- TCTTCGGGAATGGAACACCA A-3’; Runx2 (forward) 5’-CGC ACG ACA ACC GCA CCA-3’ (reverse) 5’- CAG CAC GGA GCA CAG GAA GTT-3’; Actin (forward) 5’- CGATGCCCTGAGGCTCTTTT-3’ (reverse) 5’- GGGCCGGACTCATCGTACTC-3’.
4. Western blot
Wild-type mouse와 Mats1/2 mutant mouse로부터 BMMs 세포 를 분리하여 M-CSF (30ng/ml)와 RANKL (100 ng/ml)을 48시간동 안 처리하여 파골세포 분화를 유도하였다. 배양된 세포는 Lysis buffer (50 mM Tris;pH 8.0, 150 mM NaCl. 1.5 mM MgCl2, 1mM EGTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF and complete protease inhibitor cocktail)를 이용하여 파쇄한 후, 단백질을 추출하여 Bradford assay (Bio-Rad)로 단백질 정량을 수행하였다. 각 실험군 당 40 ng의 단백질을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하였고, PVDF membrane에 transfer 하였다. 5% skim milk에 1시간 반응하여 blocking 한 후 primary antibody (anti-NFATc1 or c-Fos, Santa Cruz Biotechnology)를 4℃ overnight 반응하였다. HRP가 결합 된 secondary antibody를 이용하여 면역반응을 검출하였고, chemi-luminescence detection kit (Roche)를 통해 측정하였다.
5. Statistical analysis
연구결과의 통계분석을 위해 평균과 standard deviation 값 을 구한 후 t-test를 통해 유의성을 검증하였다. 통계적 유의성 평가를 위한 유의 수준은 0.01로 하였다 (**p<0.01).
Ⅲ. 결 과
Mats1/2가 bone homeostasis에 미치는 영향을 분석하기 위 하여, 대조군에 해당하는 wild-type마우스와 실험군에 해당하 는 다양한 Mats1/2 mutant마우스를 성별과 주령을 맞추어 준 비하였다. Mats1과 Mats2 두 가지 유전자가 모두 결손된 Mats1-/-Mats2-/- 마우스는 배아단계에서 사망하여 분석이 불가 능하였으나, Mats1과 Mats2 유전자 중 한 가지라도 보유하고 있으면 생존이 가능하다는 사실에 착안하여, Mats1+/-Mats2-/- 마우스를 가장 Mats1/2가 많이 결손된 마우스로 간주하여 분 석하였다. 따라서, 분석에 사용된 마우스의 유전자 타입을 모 두 열거하자면, Mats1+/+Mats2+/+ (Genotype I), Mats1+/+Mats2+/- (Genotype II), Mats1+/+Mats2-/- (Genotype III), Mats1+/-Mats2-/- (Genotype IV)와 같다. 위 열거된 유전자형의 5주령 수컷 마 우스로부터 femur를 분리하여 μCT분석을 수행하였다. 그 결 과 cortical bone thickness는 모든 마우스에서 유사하였으나, growth plate아래 존재하는 trabecular bone volume은 Mats1/2 가 결손된 마우스에서 유의하게 감소하여 있다는 사실을 발견 하였다 (Fig. 1a). 특히, 동일하게 Mats2가 모두 결손된 마우스 (typeIII와 type IV) 라 할지라도 Mats1유전자가 모두 존재하 면 wild-type 마우스와 표현형이 유사하지만, Mats2가 모두 결손된 조건에서 Mats1유전자를 single copy라도 보유하고 있 으면 bone volume이 감소한다는 사실을 확인하였다 (Fig. 1b). Bone quality를 나타내는 또 다른 parameter인 trabecular separation 역시 bone volume이 감소한 type IV마우스 (Mats1+/- Mats2-/-)에서 유의하게 증가하는 것으로 관찰되었다 (Fig. 1c).
Mats1/2이중결손 돌연변이 마우스에서 골량이 감소한다는 상기 연구 결과는, 골항상성을 유지하는 파골세포 또는 조골 세포의 활성에 Mats1/2가 관련되어 있다는 사실을 시사해주 므로, 파골세포와 조골세포 분화 시기별 Mats1/2의 발현양을 quantitative real-time PCR기법을 통해 확인하였다. 정상 마우 스의 골수로부터 골수유래 대식세포 (BMMs, bone marrowderived macrophage)를 분리하여 전구 파골세포로 이용하였 고, 1일령 정상 마우스의 두개골에서 calvarial pre-osteoblast 를 분리하여 전구 조골세포로 이용하여 분화실험을 진행하였 다. 그 결과, 파골세포 분화의 경우 Mats1와 Mats2의 레벨은 분화가 진행되면서 점차적으로 증가하는 패턴을 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었고, Mats1의 발현양이 분화 시기 전체 에서 Mats2보다 높다는 사실도 관찰하였다 (Fig. 2a). 조골세 포 분화의 경우, 파골세포 분화와 마찬가지로 Mats1과 Mats2 가 분화가 진행될수록 증가하는 패턴을 나타내고 있었으나, Mats1의 증가 폭이 Mats2의 증가 폭보다 월등히 높다는 결과 를 확인할 수 있었다 (Fig. 2b).
파골세포 분화 과정 중 Mats1/2가 증가한다는 사실을 바탕으 로 Mats1/2돌연변이 마우스의 파골세포 분화가 정상과 비교하여 차이가 있는지 분석하였다. Wild-type 마우스 (type I)와 Mats1/2 mutant 마우스 (type II, III, IV)의 BMMs를 분리하여 RANKL로 파골세포 분화를 유도한 결과 각 유전자형별 파골세포 분화는 큰 차이가 없다는 사실을 관찰하였다 (Fig. 3a-b). 전사인자인 NFATc1 (nuclear factor of activated T-cell)과 c-Fos는 가장 핵심 적인 파골세포 분화유도 인자로 잘 알려져 있다10,11). 파골세포 분화 과정 중, 정상 BMMs과 Mats1/2 돌연변이 BMMs에서 발현 하는 NFATc1과 c-Fos의 단백질량을 western blot으로 확인할 결과, 유전자형 별 파골세포 분화는 큰 차이가 없었다는 TRAP 염색결과와 일치하게도 NFATc1과 c-Fos의 발현양은 Mats1/2 유전자와 관련 없다는 사실을 재확인할 수 있었다 (Fig. 3c).
골항상성은 파골세포와 조골세포의 활성에 의해 조절되고, 또한 상기 결과에서 파골세포 분화는 Mats1/2유전자와 관련 성이 없는 것으로 관찰되었으므로, 조골세포 분화가 Mats1/2 유전자 결손에 의해 영향을 받는지 분석하였다. 정상 마우스 (type I)와 Mats1/2 이중결손 돌연변이 마우스 (type II, III, IV)의 두개골에서 전구 조골세포를 분리하여 조골세포 분화를 유도하였다. ALP염색으로 조골세포 분화 정도를 비교하였을 때, type IV (Mats1+/-Mats2-/-) 마우스의 조골세포 분화는 여타 마우스의 세포에 비해 조골세포 분화가 크게 저하되어 있다는 사실을 확인하였다 (Fig. 4a). 조골세포 분화를 결정하는 중요 한 전사인자는 Runx2인 점에 근거하여12,13) Runx2의 발현양을 RT-PCR로 확인한 결과 세포 분화 실험 결과와 일치하게도 Mats1+/-Mats2-/-마우스에서 그 발현양이 감소되어 있다는 사실 을 발견하였다 (Fig. 4b).
Ⅳ. 고찰
사람과 같은 다세포동물에서 인체 내 각 기관의 적절한 크기 는 기관을 구성하는 세포의 증식, 분열, 사멸에 의해 정교하게 조절된다. 약 20여년 전 초파리의 genetic screening에 의해 발 견된 Hippo pathway는 이러한 기관의 크기를 결정하는 주 신호 경로로 처음 알려졌으며, 그 후 여러 연구진의 성과에 의해 기관 의 크기를 결정할 뿐만 아니라, 암의 형성과 전이, 면역반응에도 관련된 것으로 보고되어 왔다1,2). Hippo pathway는 30개 이상 의 관련 signaling molecule에 의해 전달된다고 알려진 바 있으 며, 그 중 중요한 역할을 담당하는 인자는 Mst1/2 (mammalian Ste20-like 1/2), Lats1/2 (large tumor suppressor 1/2), Mob1 (mps one binder1) 그리고 Mats1/2 (mob as tumor suppressor) 이고, 이러한 signaling cascade는 궁극적으로 transcription factor Yap (yes-associated)과 Taz (transcriptional co-activator with PDZ-binding motif)의 활성을 조절하여 효과를 나타낸다 고 알려져 있다3,4). 위 중요 인자 중 최근 Mats1/2 이중결손 돌연 변이 마우스가 일본 연구팀에 의해 제작되었으며, 해당 마우스는 증가된 암발생률과 저하된 영양물질 대사를 나타냄으로써, Hippo pathway가 암세포 신호전달에 관련되어 있을 뿐만 아니 라, 생체 내 metabolism에도 관련되어 있음을 시사해 주었다9). 본 연구팀은 Mats1/2 이중결손 돌연변이 마우스가 보유하고 있 는 side-effect중 견치의 비정상적인 성장으로 인한 부정교합이 골대사 관련 이상증세를 반영하고 있다고 판단하고 Mats1/2 돌 연변이 마우스의 bone quality를 분석하였다. Mats1+/+Mats2+/+ (Genotype I), Mats1+/+Mats2+/- (Genotype II), Mats1+/+Mats2-/- (Genotype III)는 모두 정상에 가까운 bone phenotype을 보여 주었는데 이들 중 Mats1++-Mats2-/- (Genotype III) 마우스는 Mats2유전자가 전혀 존재하지 않음에도 불구하고, 정상 표현 형을 나타내었다. 이와 같은 사실은 Mats1과 Mats2의 기능이 상호보완적임을 시사해준다고 할 수 있다. 하지만, Mats1/2 이중결손 돌연변이 마우스는 견치가 비정상적으로 성장한 독특 한 형태의 부정교합을 가지고 있고 이로 인한 저작기능 저하로 영양물질 섭취가 부족하여 골량이 감소하였을 가능성을 배제할 수 없다. 그러나, 골량뿐만 아니라, 파골세포 분화와 조골세포 분화도 Mats1+/+Mats2-/-마우스의 세포는 정상적이었으므로, 세 포수준에서도 Mats1과 Mats2의 기능은 상보적이라고 말할 수 있고, Mats1+/-Mats2-/- 마우스에서 관찰되는 골량의 감소는 생체 대사 수준이 아닌 세포수준의 기전으로 해석할 수 있다.
Taz (transcriptional co-activator with PDZ-binding motif) 는 복잡한 Hippo pathway가 최종적으로 수렴하여 조절하게 되는 transcription factor이다. 흥미롭게도, Taz는 Runx2의 활 성을 조절하여 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell)의 지방세포로의 분화를 억제하고 조골세포로의 분화를 억제한 다고 보고된 바 있다14,15). Taz는 지방세포 분화에 필수적인 전사인자인 PPAR-gamma와 직접 결합하여 그 활성을 억제하 고 반면에, 조골세포 분화에 필수적인 전사인자인 Runx2와 직접 결합하여 그 활성을 촉진할 수 있다는 것이 밝혀졌다15). 따라서, Taz의 상위에 존재하는 Hippo pathway 구성인자인 Mats1/2가 조골세포 활성에 작용할 수 있다는 본 연구결과는 Hippo pathway와 bone metabolism을 연결할 수 있는 또 하 나의 증거로 의미를 찾을 수 있다.
