Ⅰ.서 론

5-플루오로우라실 (5-Fluorouracil, 5-FU)은 시스플라틴 (Cisplatin) 과 함께 두경부암과 유방암 및 위장관암을 포함한 각종 악성 종양의 화학요법에서 가장 널리 쓰이는 항암제 중에 하나이며 우수한 항암효과에도 불구하고 10~30%의 낮은 반응 효율과 약제의 내성 때문에 임상적 적용에 상당한 제약을 받고 있 다.^1,2) DNA 사슬에 가교를 형성하여 DNA 구조에 직접적으로 작용하는 시스플라틴과 달리 5-FU는 우라실의 C-5위치 수소가 불소로 치환된 우라실 유사체로서 세포 내에서 fluorodeoxyuridine monophosphate (FdUMP), fluorodeoxyuridine triphosphate (FdUTP), fluorouridine triphosphate (FUTP)와 같은 대사물 질로 전환되어 DNA와 RNA의 생합성 과정에서 대사길항제 (antimetabolite)로서 작용하는 것으로 알려져 있다.³⁾

5-FU의 대사물질인 FdUMP는 티미딜산 합성효소 (thymidylate synthase, TS)의 억제제로서 TS가 deoxyuridine monophosphate (dUMP)를 메틸화하여 deoxythymidine monophosphate (dTMP) 를 형성하는 기전을 방해함으로써 DNA 합성과 수복에 필요한 티미딜산 (thymidylate)의 합성을 저해하고 빠르게 분열하는 암세포의 성장을 방해하며, FdUTP와 FUTP는 각각 DNA와 RNA 에 함유되어 정상적인 핵산의 합성과 기능에 장애를 일으켜 세포독성과 세포사멸을 초래한다.⁴⁾

5-FU는 dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD)에 의해 dihydrofluorouracil (DHFU)로 이화되며 투여된 5-FU의 80% 이상이 간에서 제거되지만 DPD의 결함이 있는 환자의 경우 에는 심각한 독성을 나타낼 수 있다.^5,6) 5-FU는 위장관 내에서 인산화가 이루어지므로 소화장애 및 골수 장애 등의 부작용이 생길 수 있으며 이외에도 수족증후군(hand-foot syndrome), 신경독성 및 심장독성을 초래할 수 있다.¹⁾ 5-FU는 DPD에 의 해 신속하게 체내에서 분해되므로 작용시간이 비교적 짧으며 조직과 환자에 따라 다르게 나타나는 DPD의 활성도와 기타 약물의 대사 관련 효소 및 보조효소, TS의 활성도 및 관련 인 자들의 변화 등이 5-FU의 효율에 영향을 준다.⁷⁾

본 연구에서는 5-FU가 TS의 높은 발현유도로 신속한 세포 내성이 생기는 것으로 알려져 있지만,^2,8) 5-FU는 치료가 어려 운 구강암 치료에도 사용되므로 본 연구에서는 구강암 세포주 인 KB 세포를 사용하여 5-FU가 KB 세포에 미치는 항암작용 의 단백질 신호전달 체계 변화를 관찰하기 위한 일련의 in vitro 실험을 수행하였다. 특히 단백질 발현을 보다 정확하게 측정하기 위하여 면역침전 고성능 액체크로마토그라피의 방 법을 사용하였다.⁹⁾ 결과적으로 5-FU의 투여에 의하여 KB 세 포 내에서 매우 다양하고 의미 있는 단백질 신호전달 통로의 변화를 관찰하였다.

Ⅱ.실험재료 및 방법

1.KB 세포 배양 및 단백질 추출

KB 세포 (ATCC, USA) 배양을 위하여 열처리로 항원성을 비활성화시킨 fetal bovine serum (WelGene Inc. Korea), 100 units/mL penicillin, 100 ug/mL streptomycin, 및 250ng/mL amphotericin B (WelGene Inc. Korea)를 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, WelGene Inc., Korea) 배 양액을 사용하였다. KB 세포를 배양액에 넣어서 5% CO2/95% 대기압 및 37.5℃를 유지하는 배양기에서 배양하였다. KB 세 포들은 mycoplasma 오염 검색에서 음성반응을 보였다.

페트리디쉬에서 세포들이 활발하게 자라서 KB 세포들이 약 70%의 페트리디쉬 표면을 채웠을 때 5μM 5-fluorouracil (5-FU) 용액을 투여하였다. 대조군에는 생리 식염수를 투여하 였다. 5-FU는 특징적으로 정상적인 RNA 핵산의 대사과정에 서 UTP를 FUTP로 치환해서 정상적인 단백질의 번역이 이루 어지지 않게 되는 작용을 하므로 비교적 장시간의 관찰이 필 요하다. 따라서 대조군 및 실험군의 배양액을 최대한도로 사 용하였으며 실험군들은 5-FU 용액을 투여하여 12, 24, 48, 72, 및 96 시간 후에 배양액을 제거하고 약 1×10¹⁰ KB 세포들에서 단백질을 추출하였다. 본 연구에서는 지름이 150 mm 인 페트 리디쉬에 80 mL의 배양액을 사용하였다. 단백질 추출을 위하 여 얼음 위에서 단백질용해 완충액 (PRO-PREP^TM, iNtRON Biotech., USA)을 사용하여 KB 세포들을 용해하였으며 단백 질 용해액을 1600g 에서 30분 동안 원심분리 한 후 상청액을 사용하였다. 단백질 추출액의 농도를 알기 위하여, 단백질 농 도분석 용액 (Bio-Rad Laboratories Inc., USA)을 사용해서 UV 스펙트로메터에서 592nm의 흡광도를 측정하여 통법에 의 하여 단백질 농도를 산출하였다. 대조군 및 실험군의 단백질 추출액들은 -70°C 냉동고에 보관한 후에 사용하였다.

2.면역침전 고수행 액체크로마토그라피 분석

단백질의 발현분석을 정확하고 빠르게 동시에 다수의 분석 이 가능하도록 하기 위하여 소량의 단백질 분석방법을 미세정 밀 HPLC 자동화 장치 (Agilant, 1050, Germany)에 사용하였 으며¹⁰⁾ 구체적인 실험방법은 다음과 같다.

1)Protein A/G 아가로즈 비드에 항체의 부착

Protein A와 G (Amicogen Co., Korea)가 혼합된 아가로즈 비드를 Tris-NaCl 완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15M NaCl, 1mM EDTA)에 넣고 목적하는 항체를 넣어 25°C에서 1시간 동안 회전시키면서 혼돈 상태 (chaos) 반응을 유지하여 protein A/G 비드에 항체를 부착시켰다. 이 때에 약 1 mL protein A/G 비드에 1 μg 의 IgG 항체를 반응시켰으며 15 mL 튜브에 12 mL의 Tris-NaCl 용액을 사용하였다. 본 연구에 서는 32종류의 항체를 사용하였다. (Table 1)

2)항체가 부착된 protein A/G 아가로즈 비드 콜룸에서 단백질 추출물의 반응 및 세척

Protein A/G 아가로즈 비드를 콜룸 (Bio-Rad mini column, USA)에 넣고 단백질 결합 완충액 (1 L Tris-NaCl 완충액, 0.5 mL Tween-20)을 채운 다음 단백질 추출액을 첨가하여 밀봉 한 후에 25°C에서 2시간 동안 회전시키며 혼돈 상태 (chaos) 반응을 유지하여 목표 단백질을 항체에 부착시켰다. 본 연구 에서는 약 200 μL의 protein A/G 아가로즈 비드에 10 mL의 단백질 결합 완충액을 사용하였고 약 100 μg의 단백질 추출액 을 반응시켰다.

목표 단백질이 부착된 protein A/G 아가로즈 비드를 세척 하기 위하여 단백질 결합 완충액을 콜룸에서 제거하고 15 mL Tris-NaCl 완충액으로 3차례 세척한다. 완충액에 들어 있는 Tween-20와 Tris 성분은 HPLC 분석에 방해가 되므로 이들을 제거하기 위하여 15 mL의 0.15M NaCl 용액으로 다시 3차례 세척한다.

3)Protein A/G 아가로즈 비드에서 목표 단백질의 용출

Protein A/G 아가로즈 비드에서 목표 단백질을 용출하고 그 용액을 HPLC로 분석하기 위해서 특정한 용출액을 사용하 였다. 우선 UV 스펙트럼에 영향을 미치지 않기 위하여 1.5M NaCl 용액을 선택하고, 부착성이 높은 단백질들이 HPLC 콜룸 에서 자유롭게 통과하기 위해서 20% acetonitrile (ACN) 용액 성분을 추가하였다. 본 연구에서는 약 200 μL의 Protein A/G 아가로즈 비드에 부착되어 있는 단백질을 용출하기 위하여 약 300 μL의 용출액 (1.5M NaCl, 20% ACN)을 사용하였다.

4)용출된 목표 단백질의 HPLC 검색

단백질 미세 정량분석을 위한 고성능 HPLC를 선택하고 부 착성이 최소인 실리카 비드 성분으로 충전된 콜룸을 사용하였 다. UV 스펙트럼의 크기가 10 mAU 인 수치의 정량을 위하여 HPLC의 유체상 이동속도를 최소로 하고 지속적인 정량분석 이 이루어지기 위하여 펌프의 압력을 최소로 하여 진행하였 다. 본 연구에서는 실리카 비드의 크기가 30 μm 인 콜룸을 사용하였으며 유동 완충액 (0.15M NaCl, 20% ACN)이 0.5 mL/min의 속도로 이동하는 상태에서 약 200 μL의 단백질 용 출액을 주사하여 280 nm의 파장에서 약 30분 동안 검색한 결과 다수의 HPLC 피크를 얻었다. HPLC는 표본 자동주사 장 치를 사용해서 연속하여 일정한 분석이 이루어지게 하였다.

5)IP-HPLC 결과에 대한 통계학적인 분석

HPLC에서 얻은 다수의 피크 면적 값 (A) 에는 소량의 목표 단백질과 사용된 항체에 의해서 생기는 UV₂₈₀ 흡광 값이 혼합 되어 있으므로 항체에 해당하는 값 (B)이 제거되어야 한다. 따라서 용출액 (elution buffer)과 항체만을 사용하여 수행한 추가 실험으로 얻은 HPLC 피크 값이 B가 된다. 그리고 반복 된 실험에서 연산을 통해 B 값은 대략 A 값의 0.5±α 가 된다. HPLC 면적 값은 각 피크들에 대한 단백질 농도의 제곱 값이 므로 총 단백질 농도를 알기 위해서는 HPLC 피크 면적의 제 곱근을 구하여야 한다. 즉, A − A × ( 0.5 ± α ) 가 목표 단백 질의 농도가 된다. 이 때 α 값은 모든 세포 내에 고르게 분포 되어 있는 세포지킴이 단백질 (housekeeping protein)인 β -actin과 α-tubulin의 발현변화가 ±5% 이내가 되도록 설정한 다. 이렇게 얻은 각각의 목표 단백질의 농도는 통법에 의하여 Chi-square 검사 등에 의한 통계학적 처리를 통하여 실험군의 평균 값 및 오차 값을 대조군의 값들에 대한 비율 퍼센트 (%) 로 환산하여 처리하였다.

Ⅲ.연구결과

KB 세포에 5-FU를 투여한 후에 세포의 증식, 방어, 생존, 및 세포자멸사에 관여하는 다양한 단백질들의 발현량을 관찰 하였으며, 각각의 실험군들의 발현량은 대조군의 발현량에 대 한 % 비율로 나타냈다. 한편, 각각의 단백질 발현변화들은 모 든 세포들에 고르게 분포되어 세포지킴이 역할을 하는 단백질 들인 β-actin과 α-tubulin의 발현변화와 비교하였다.

1.5-FU 투여에 의한 KB 세포의 세포증식-관련 단백질 발현변화

KB 세포에 5-FU를 투여한 후에 세포증식 인자인 CDK4 (cyclin dependent kinase 4), Ki-67, PCNA (proliferating cell nuclear antigen), 그리고 MPM2 (mitotic protein monoclonal 2) 들과 세포증식 억제인자인 p16과 p21 등의 단백질 발현량 을 대조군에 비교해서 관찰하였다. 5-FU 투여 후에 나타나는 세포증식-관련 단백질들의 발현량 변화들이 5-FU 투여 후에 시간이 지남에 따라 크게 변하는 경향을 보이므로 5-FU 투여 후의 시간 별로 분석하면 다음과 같다.

5-FU 투여 후 12 시간에는 관찰한 모든 단백질의 발현이 5% 이내의 미미한 변화를 보였다. 5-FU 투여 후 24 시간에는 10% 이상의 비교적 큰 차이의 단백질 발현이 나타났는데, p21 은 19.4% 증가하였고, p16은 6.7% 증가하였는데 비하여, Ki-67은 11.1% 감소하였으며 PCNA는 4.8% 감소하였다.

5-FU 투여 후 48 시간에는 p21의 증가가 커져서 25.5% 증 가하였으며 Ki-67의 감소도 더 커져서 13.3% 감소되었으며 PCNA는 6.1% 감소되었다. 5-FU 투여 후 72 시간에는 p21의 증가가 둔화되어서 17.5% 만 증가되었는데, Ki-67의 감소는 더 커져서 14.6% 감소되었고 PCNA의 감소도 커져서 7.6% 감소되었다.

5-FU 투여 후 96 시간에는 p21의 발현이 크게 감소되어 대조군 발현변화에 비해 ±5% 이내로 회복되었는데, Ki-67의 발현은 지속적으로 감소되어 17.4%의 큰 감소폭을 보였다. 한편, CDK4와 MPM2의 발현은 실험기간 동안 세포지킴이 단백질들의 발현변화인 ±5% 이내의 미미한 변화를 보였다 (Fig. 1A).

따라서 KB 세포들에 대한 5-FU의 세포증식억제 효과는 주 로 DNA 코드 이상에 의해 증가된 p53의 후방인자인 p21의 활성화가 세포증식을 강하게 억제시키는 것으로 나타났으며, 마찬가지로 리보솜 RNA 전사에 중요한 역할을 하는 Ki-67의 발현을 억제함으로써 세포증식을 크게 감소시켰다 (Fig. 1B).

2.5-FU 투여에 의한 KB 세포의 cMyc/MAX/MAD 네트워크-관련 단백질 발현변화

KB 세포에 5-FU를 투여한 후에 세포증식을 제어하는 cMyc/MAX/MAD 네트워크 인자들의 발현량을 대조군에 비교 해서 관찰하였다. 5-FU 투여 후에 나타나는 세포증식을 제어 하는 cMyc/MAX/MAD 네트워크 인자들의 발현량 변화들이 5-FU 투여 후에 시간이 지남에 따라 크게 변하는 경향을 보이 므로 5-FU 투여 후의 시간 별로 분석하면 다음과 같다.

5-FU 투여 후 12 시간부터 세포증식을 억제하는 MAD의 발현이 5.7% 증가되었으며 반면에 세포증식을 유도하는 MAX (myc-associated factor X)와 cMyc (V-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog)의 발현이 각각 6.7%와 6.4% 감소 되었다. 5-FU 투여 후 24 시간에는 MAD의 발현이 더욱 커져 서 8.1% 증가하였으며 MAX는 더 적어져서 7.3% 감소되었다.

5-FU 투여 후 48 시간에는 MAX의 발현이 최소치를 보여서 8.4% 감소되었는데 MAD의 발현은 다소 적어져서 증가량이 5.2%로 나타났다. 5-FU 투여 후 72 시간에는 MAX의 감소가 다소 완화되어 7.3%의 감소를 보였으며 MAD의 증가도 완화 되어 3.2%의 증가에 그쳤다.

5-FU 투여 후 96 시간에는 MAX의 발현감소가 대조군에 비 해 -5% 이내의 약한 감소로 회복되었으며, MAD의 증가폭도 1.1%로 대조군과 거의 유사한 크기로 회복되었다. 한편, cMyc은 5-FU 투여 후 48 시간부터 감소폭이 점차적으로 감소 되어 5-FU 투여 후 96 시간에는 2.6% 감소를 보이면서 회복되 어 가는 경향을 나타냈다 (Fig. 2A).

따라서 5-FU 투여에 의한 세포증식억제 효과는 cMyc/MAX /MAD 네트워크에 신호전달에 주요하게 작용하는 것으로 나 타났으며 cMyc/MAX의 결합은 크게 감소되고 cMyc/MAD의 결합이 크게 증가되어 결과적으로 세포증식이 효과적으로 억 제되었다 (Fig. 2B).

3.5-FU 투여에 의한 KB 세포의 세포방어 및 생존 -관련 단백질 발현변화

KB 세포에 5-FU를 투여한 후에 세포방어 인자인 NFkB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells), p38, MDR (multiple drug resistance), p-mTOR (mammalian target of rapamycin) 및 TNFα (tumor necrosis factor-α)의 발현과 세포생존에 관여하는 TGF-β1 (transforming growth factor-β1), pAKT1/2/3 (v-akt murine thymoma viral oncogene homolog, phosphorylated Thr 308), hTERT (human telomerase reverse transcriptase) 및 AMPK (AMP-activated protein kinase )의 발현을 대조군에 비교해서 관찰하였다. 5-FU 투여 후에 나타나는 세포방어인자들과 세포생존에 관여하는 단백질들의 발현량 변화들이 5-FU 투여 후에 시간이 지남에 따라 크게 변하는 경향을 보이므로 5-FU 투여 후의 시간 별로 분석하면 다음과 같다.

5-FU 투여 후 12 시간에는 세포방어 인자인 NFkB, MDR, p-mTOR, 그리고 TNFα의 발현들이 각각 2.4%, 1.6%, 5.9%, 그리고 5.7% 감소되었으나 세포의 스트레스 상태를 나타내는 p38은 4.3% 증가되었다. 한편, 세포생존에 관여하는 pAKT1/ 2/3, hTERT, 그리고 AMPK의 발현들은 각각 1%, 1.2%, 그리 고 6.7% 감소되었으나 세포변형에 관여하는 TGF-β1의 발현 은 2.9% 증가되었다.

5-FU 투여 후 24 시간에는 세포방어 인자인 NFkB, MDR, 그리고 p-mTOR, 발현들이 각각 4.9%, 3.3%, 그리고 5.3%로 그 감소폭이 더 커졌으나 TNFα는 감소폭이 다소 완화되어 3.1% 감소되었으며 세포의 스트레스 상태를 나타내는 p38은 증가폭이 더 커져서 6.8% 증가를 보였다. 한편, 세포생존에 관여하는 pAKT1/2/3, hTERT, 그리고 AMPK의 발현들은 감소 폭이 더 커져서 각각 6.7%, 2%, 그리고 9.7% 감소를 보였으며 세포변형에 관여하는 TGF-β1의 발현은 크게 커져서 7.3% 증 가되었다.

5-FU 투여 후 48 시간에는 세포방어 인자인 NFkB, MDR, p-mTOR, 그리고 TNFα발현들이 각각 4.9%, 7.2%, 6.4%, 그리 고 5.9%로 감소폭이 더 커졌으며 세포의 스트레스 상태를 나 타내는 p38은 증가폭이 더 커져서 11.3% 증가를 보였다. 한 편, 세포생존에 관여하는 pAKT1/2/3는 감소가 다소 완화되어 4.3%를 보였지만 hTERT와 AMPK의 발현들은 감소폭이 더 커 져서 각각 3.6% 와 10.7% 감소를 보였으며 세포변형에 관여 하는 TGF-β1의 발현은 더 커져서 8.9% 증가되었다.

5-FU 투여 후 72 시간에는 세포방어 인자인 NFkB, MDR, 그리고 p-mTOR, 발현들의 감소폭이 다소 완화되어 각각 2.4%, 5.5%, 그리고 5.6%으로 감소되었으나 TNFα의 감소폭 은 더 커져서 9.7%의 감소를 보였다. 그리고 세포의 스트레스 상태를 나타내는 p38은 증가폭이 매우 적어져서 2.7%의 증가 를 보였다. 한편, 세포생존에 관여하는 pAKT1/2/3는 감소폭 이 커져서 5.5%의 감소를 보였지만 hTERT와 AMPK의 발현들 은 감소폭이 완화되어 각각 0.2% 와 7.4% 감소를 보였으며 세포변형에 관여하는 TGF-β1의 발현은 매우 커져서 17.3% 증가되었다.

5-FU 투여 후 96 시간에는 세포방어 인자인 NFkB, MDR, 그리고 p-mTOR, 발현들의 감소폭이 크게 완화되어 각각 0.5%, 1.9%, 그리고 1.4%으로 대조군과 유사하게 회복되는 경향을 보였지만 TNFα의 감소폭은 지속적으로 7.1%의 감소를 보였다. 그리고 세포의 스트레스 상태를 나타내는 p38은 0.5% 감소를 보이면서 회복되는 경향을 보였다. 한편, 세포생존에 관여하는 pAKT1/2/3, hTERT 그리고 AMPK의 발현들은 대조 군과 유사하게 회복되는 경향을 보였지만 세포변형에 관여하 는 TGF-β1의 발현은 지속적으로 17.3% 증가되었다 (Fig. 3A).

따라서 KB 세포들에 대한 5-FU 투여는 KB 세포의 방어 능력을 약화시키면서 스트레스가 매우 큰 상태로 유도시킬 뿐 아니라 세포 생존 능력도 약화시키고 이에 대한 염증반응도 감소시켰다. 반면에 5-FU 투여에 대하여 KB 세포의 변형을 크게 증가시킬 수 있는 TGF-β1가 활성화되는 것이 관찰되었 다 (Fig. 3B).

4.5-FU 투여에 의한 KB 세포의 p53-중재 세포자 멸사-관련 단백질 발현변화

KB 세포에 5-FU 투여 후에 나타나는 p53-중재 세포자멸사 에 관여하는 단백질들의 발현량 변화들이 5-FU 투여 후에 단 백질의 종류에 따라 크게 변하는 경향을 보이므로 5-FU 투여 후에 나타나는 각각의 단백질 발현변화 별로 분석하면 다음과 같다.

p53의 발현은 5-FU 투여 후 24 시간에 5%의 증가를 보였을 뿐 실험기간 동안 +5% 이내의 미미하게 증가되었으며, p53의 신호가 전달되는 BAX도 5-FU 투여 후 48 시간에 7%의 증가 를 보이다가 72 시간 후에는 오히려 4.5% 감소되는 경향을 보였고, BAX에 의해 유도되는 세포자멸사 실행인자인 APAF-1의 발현도 5-FU 투여 후에 오히려 점차적으로 감소되 어 5-FU 투여 후 96 시간에는 10.2%로 크게 감소되었다.

반면에 AIF, caspase 9, c-caspase 9, PARP, c-PARP 등의 세포자멸사 인자들의 발현들이 매우 크게 증가하는 현상이 관 찰되었다. AIF (apoptosis inducing factor)는 5-FU 투여 후 48 시간에 가장 크게 커져서 9.9% 증가되었으며 96 시간까지 지속적으로 증가되었다. DNA 단일가닥의 결손을 회복시키는 역할을 하는 PARP (Poly (ADP-ribose) polymerase)는 5-FU 투여 후 24 시간에 신속하게 19.2% 증가되었으며 이후에 96 시간까지 11.1-16.3% 정도의 높은 발현증가를 보였으며, PARP 단백질에서 절단되어 실제로 기능을 하는 c-PARP의 발 현도 점진적으로 증가되어 5-FU 투여 후 72 시간에 12.1%의 큰 증가를 보였다.

그리고 미토콘드리아에서 유래되는 caspase 9과 이 단백질 에서 절단되어 실제로 apoptosis의 기능을 하는 c-caspase 9의 발현들도 5-FU 투여 후에 점진적으로 큰 증가를 보였다. 즉, caspase 9은 5-FU 투여 후 72 시간에 11.2%의 최대 증가를 보였는데 c-caspase 9은 5-FU 투여 후 24 시간에는 증가를 보 이지 않지만 48 시간에는 7.1%, 72 시간에는 19%, 그리고 96 시간에는 25.9%의 급격한 발현증가가 지속되었다 (Fig. 4A).

따라서 KB 세포들에 대한 5-FU의 투여가 미치는 p53-중재 세포자멸사는 p53/BAX 신호전달에 의한 기전이기 보다는 5-FU 투여에 의해 발생한 DNA의 결손에 대해 PARP 인자가 직접 관여하여 과다한 PARP 및 c-PARP 발현으로 NAD⁺가 소 진되며 ATP 결핍에 의한 미토콘드리아의 기능이 정지되면서 caspase 9 및 c-caspase 9이 생성됨으로써 파국적인 세포자멸 사가 신속하게 진행되는 현상이 나타났다 (Fig. 4B).

5.5-FU 투여에 의한 KB 세포의 FAS-중재 세포 자멸사-관련 단백질 발현변화

KB 세포에 5-FU 투여 후에 나타나는 FAS-중재 세포자멸사 에 관여하는 단백질들의 발현량 변화들이 5-FU 투여 후에 단 백질의 종류에 따라 크게 변하는 경향을 보이므로 5-FU 투여 후에 나타나는 각각의 단백질 발현변화 별로 분석하면 다음과 같다.

세포 밖에서 전달되는 세포자멸사 신호인자인 FASL의 발현 은 5-FU 투여 후 96 시간까지 미약하게 2.7%의 증가를 보였으 며, FASL의 수용체인 FAS의 발현은 5-FU 투여 후 96 시간까지 점진적으로 적어져서 10.9% 감소되었다. 이는 5-FU 투여에 의한 세포자멸사는 FASL/FAS 신호전달에 의한 것이 아님을 나타낸다.

반면에 세포자멸사의 개시효소인 caspase 8과 작동효소인 caspase 3의 발현은 5-FU 투여 후에 지속적으로 증가되어서 caspase 8은 5-FU 투여 후 72 시간에 8.6%의 최대 증가를 보 였고 caspase 3도 5-FU 투여 후 72 시간에 16.3%의 최대 증가 를 보였다. 대체로 caspase 8과 caspase 3의 발현변화들이 서 로 유사하게 나타났는데 이들의 발현량 변화는 또한 PARP 및 c-PARP의 발현량 변화와 5-FU 투여 후 96 시간 동안 서로 비슷한 정도를 보였다 (Fig. 5A).

따라서 KB 세포들에 대한 5-FU의 투여에 의해 생기는 세포 자멸사에는 FAS-중재 신호전달의 영향은 거의 없고 오히려 PARP 및 c-PARP의 과다발현에 의한 이차반응으로 caspase 8과 caspase 3들이 활성화되어 세포자멸사가 발생되는 것으 로 나타났다 (Fig. 5B).

Ⅳ.총괄 및 고찰

5-FU 투여에 의해서 KB 세포에서 세포증식에 관여하는 Ki-67, PCNA, 및 MPM2 등의 단백질들이 5-FU 투여 후 96 시간 동안 지속적으로 감소되었는데, 특히 대표적인 세포증식 억제 인자인 p21의 발현이 5-FU 투여 후 48 시간까지는 매우 심한 발현증가 (25.5%)를 보이다가 증가폭이 감소 되어 72 시간에는 17.5%, 그리고 96 시간에는 거의 대조군 세포의 발 현량과 유사하게 나타났다. 이는 5-FU의 대사산물들이 DNA 합성에 필요한 피리미딘인 티미딘을 합성하는 효소인 TS를 차단하여 세포증식을 방해하거나 DNA와 RNA 사슬에 삽입되 어 비정상적인 핵산을 합성하는 대사길항제로서 작용하므로 일정한 시간이 필요하며 또한 빠르게 대사과정에서 분해되어 소멸될 수 있으므로 5-FU의 항암작용 시간이 비교적 제한적 인 것을 본 연구의 세포증식-관련 단백질 발현 분석에서 알 수 있다.³⁾

또한 KB 세포들에 대한 5-FU의 세포증식억제 효과는 주로 DNA 코드 이상에 의해 증가된 p53의 후방인자인 p21의 활성 화가 CDK를 억제하여 세포증식을 강하게 감소시키는 것으로 나타났으며, 마찬가지로 리보솜 RNA 전사에 중요한 역할을 하는 Ki-67의 발현을 억제함으로써 세포증식을 양방향에서 크 게 감소시켰다.¹¹⁾

cMyc/MAX/MAD network는 세포증식 신호전달에 매우 큰 영향을 미치는 요소이며 5-FU 투여후 96시간 동안 세포증식 촉진 인자인 MAX의 발현량이 지속적으로 감소 (91.6%) 되었 으며, 세포증식 억제인자인 MAD의 발현량은 투여 후 24 시간 에 108.1%로 최대 발현량을 보이고 96시간까지 서서히 대조 군과 동일한 수준으로 감소되었다.¹²⁾ 이는 5-FU가 KB 세포에 서 cMyc에 의한 세포증식을 직접적으로 억제시킬 수 있음을 나타내며 투여 후 최소한 96시간 동안 5-FU의 항암효과를 기 대할 수 있음을 의미한다.

KB 세포들에 5-FU 투여가 미치는 세포반응으로 세포의 방 어기전에 대한 단백질발현을 NFkB 및 pAKT 신호전달체계로 관찰한 결과 5-FU가 KB 세포들을 매우 심하게 자극시켜서 세 포 스트레스 인자인 p38의 발현이 두드러지게 나타났다.^8,13) p38의 발현은 5-FU 투여 후 48시간에 111.3%로 최대 증가량 을 보이다가 점차 감소되어 투여 후 96 시간에는 대조군과 거의 동일한 수준으로 감소되었다. 또한 TGF-β1의 발현이 5-FU 투여 후 96시간 동안 지속적으로 증가하여 96시간에는 117%의 최대수준을 보였다. 이는 5-FU 투여에 의해서 KB 세 포가 5-FU의 세포독성에 대한 세포변형을 촉진하는 내성을 갖게 할 수 있는 TGF-β1의 발현증가는 매우 큰 의미가 있 다.^14,15)

한편, 세포 방어 신호체계에 속하는 NFkB, pAKT, 및 AMPK 등의 활성 단백질들의 발현은 모두 현저하게 감소되었 다. 이는 5-FU의 투여가 KB 세포에 매우 심각한 세포 독성을 일으키고 있음을 간접적으로 나타내며, 5-FU의 투여량을 되도 록 줄이고 다른 보조적인 약물 투여를 병행하는 것이 도움이 될 것으로 사료된다.^16-18)

5-FU 투여에 의한 KB 세포의 세포자멸사는 매우 현저하게 나타나는 것으로 알려져 있는데 본 연구에서는 5-FU 투여가 세포자멸사를 일으키는 세포전달 기전에 대하여 살펴 보았다. 일반적으로 잘 알려진 p53-중개 세포자멸사와 FAS-중개 세포 자멸사를 중심으로¹⁹⁾ 각각의 세포자멸사 관련 단백질들의 발 현량을 측정한 결과, 매우 특징적으로 c-caspase 9, caspase 9, caspase 3, PARP, c-PARP 등의 발현들이 5-FU 투여 후 24 시간부터 심하게 증가되었으며 c-caspase 9은 투여 후 96시간 에도 지속적으로 증가되어 125.9%의 높은 수준을 보였다. 특 히 c-PARP의 발현이 5-FU 투여 후 점차 증가되어 72시간에 112.1%로 최대 발현증가를 나타나면서 세포자멸사를 일으키 는 AIF의 발현 증가가 뒤따랐다. 반면에 p53, BAX, APAF-1, FAS, FASL, caspase 8, 등의 단백질들의 발현은 오히려 감소 하거나 비교적 큰 변화가 없는 것으로 측정되었다. 이는 5-FU 투여에 의한 KB 세포들의 세포자멸사 현상이 p53 이나 FAS에 의한 신호전달의 영향을 받는 것이 아니라 핵 내 신호전달 체 계인 PARP에 의한 세포자멸사 신호전달이 크게 작용하고 있 음을 의미한다.^20,21)

5-FU는 세포 내에서 dTTP의 생산을 억제시켜서 결과적으 로 정상적인 DNA 염기쌍을 만들지 못하게 하는데,²²⁾ 이는 다 른 alkylating agent 들에 의해 생기는 DNA 사슬 결손과 차이 가 있어서 p53에 의한 DNA repair가 어려운 상태이므로 본 연구에서는 p53의 발현 증가가 비교적 저조하였으며 p53-중 개 세포자멸사가 활성화 되지 못한 것으로 추측된다. 마찬가 지로 5-FU는 그 자체가 활성산소를 생산하는 독성물질이 아 니므로 TNFα, FASL 및 FAS 발현에 영향을 미치지 않아서 FAS-중개 세포자멸사가 활성화 되지 않은 것으로 생각된다. 그러나 5-FU에 의하여 생성된 비정상적인 DNA 염기쌍은 DNA 전사 (transcription)나 복제 (polymerization)와 같은 DNA의 기능장애를 초래하므로 결과적으로 PARP 발현 및 핵 내의 세포자멸사 신호전달이 활성화 될 것으로 여겨진다.

본 연구에서는 단백질 발현을 정확하게 측정할 수 있는 IP-HPLC 분석을 통해서 구강암 세포주인 KB 세포 내에서 5-FU의 항암 기전과 관련된 단백질 신호전달체계를 관찰하였 으며 항암제에 의한 세포자멸사 기전이 cisplatin, cyclosporine, methotrexate 등과는 다른 양상을 보였다. 향후에 5-FU의 항암 치료를 효과적으로 진행하기 위해서는 보다 다양한 단백질 신 호전달체계를 포괄적으로 연구하여야 할 것으로 사료된다.