Ⅰ.INTRODUCTION
산소는 생명유지에 절대적으로 필요한 원소이지만 각종 물 리적, 화학적, 환경적 요인 등에 의하여 반응성이 매우 큰 활 성산소로 전환되어 생체에 치명적인 영향을 미친다. 즉 이들 활성산소는 세포 구성성분들 인지질, 단백질, 유전자 등에 대 하여 비 선택적, 비가역적인 산화반응을 유발하여 면역체계를 파괴함으로써 노화 및 각종 질병을 일으키는 것으로 밝혀졌다 1,2). 활성산소는 정상적인 세포 대사과정에서도 일부 생성되 고 있으며 체내에서는 각종 항산화효소와 항산화물질에 의하 여 제어된다. 항산화물질은 식품산업, 의약산업, 화장품 산업 등 다양한 분야에서 이용 될 수 있기 때문에 국가 경제 산업적 측면에서 매우 큰 파급효과를 기대 할 수 있다3). 특히 지금까 지 알려진 항산화제가 약한 활성, 독성 및 사용상의 한계로 인하여 의약활성 물질로 사용하는 데에 있어서 많은 문제점이 있어서4), 보다 안전하고 강한 활성을 지닌 신규 천연 항산화 제의 개발이 요구된다. 이미 육상생물에 관한 연구는 많이 진 행된 반면에 생물계의 95%를 차지하고 있는 해양생물을 이용 한 연구는 미비하며 앞으로 해양생물을 이용한 미지의 천연물 질 개발에 대한 기대가 크다5).
미더덕 (Styela clava)은 척색동물문 미색동물아문, 해초강, 측성해목초에 속하는 해양생물로서, 가늘고 긴 몸에 자루가 있고 그 끝이 바위에 부착해서 서식하며 전체길이는 5~10 cm 로서 황갈색을 띈다. 외피는 섬유질과 같은 물질로 되어있고 딱딱하며, 바닷물이 들어오고 나가는 구멍이 몸에 있어 영어 로는 우렁쉥이 (멍게)와 같이 sea squirt로 불린다6).
미더덕은 우리나라 전역에서 발견되고 있으나, 경상남도 마 산시에서 우리나라 소비량의 80% 정도를 생산하고 있다. 독 특한 맛과 향긋한 향 때문에 연중 소비되고 있으며, 4월부터 7월 사이가 생산량이 가장 많은 시기이다. 미더덕에 대한 연 구는 sterol 함량7)과 계절에 따른 영양성분 조성의 변화8) 등 주로 성분에 대한 연구가 대부분이었으며, 기능성 성분으로는 껍질로부터 glycosaminoglycan을 추출한 예9)가 있다.
바닷물에는 여러 가지 염류와 중금속들이 있으며 또한 많 은 자유 라디칼이 존재하기 때문에 바다에 서식하는 생명체는 자신을 보호하기 위해서 항산화 물질을 분비 한다10). 멍게나 미더덕은 표피가 두꺼운 셀룰로오스로 되어 있기 때문에 바닷 물에 심한 자유라디칼로부터 자신을 보호 할 수 있으나 내부 에는 매우 연한 조직으로 되어 있다11). 따라서 멍게나 미더덕 은 흡입한 바닷물을 항산화 물질로 정화시켜서 생활성에 도움 이 되는 성분으로 바꾸는 것으로 여겨지며, 특히 미더덕 낭액 은 소화관에서 나온 분비액이 모인 것으로 고등동물에서의 타 액 성분과 같은 역할을 한다12). 실제로 미더덕은 치아와 같은 저작기관이 없기 때문에 단순히 흡입구를 통해서 바닷물 속의 플랑크톤을 소화시켜 영양분을 흡수한다. 따라서 미더덕의 낭 액에는 다양한 소화액과 자신을 보호 할 수 있는 항산화 물질 의 분비가 예상된다.
암은 2003년도 우리나라 전체 사망원인의 25.9%를 차지하 여 사망 원인 1위를 차지하고 있어 국민 건강에 매우 위협적 이다13). 암은 조기에 발견되지 못할 경우 완치가 거의 불가능 하고, 병이 진전될수록 환자와 가족의 고통과 경제적 손실이 막대하며 의료보험의 재정 고갈 등 사회적으로도 큰 비용을 초래한다14). 그러므로 단순한 수명 연장보다 즐겁고 건강한 삶이 중요한 관심사로 대두되고 있는 요즘에는 암의 예방과 조기 치료의 중요성은 매우 크다15). 최근에는 암의 발생과 전 이, 암세포의 생리, 암의 진단과 치료에 대한 연구와 함께 식 품을 비롯한 항암효과를 지니는 물질 검색을 통하여 새로운 암 치료제가 개발되고 있는 추세이다. 이것은 암이 발병되어 진행이 계속될 경우 수술, 약물 처방 및 방사선치료 등을 통한 집중적인 치료를 해야 하지만 이와 같은 약물치료는 그 독성 들의 후유증을 배제할 수 없으므로 최근 항암 및 암 예방이 우수한 새로운 천연물 중에서 안전성이 있는 약물 개발이 절 실히 요구 된다16,17).
본 연구에서는 미더덕 낭액의 성분을 조사하고 특성을 연 구하던 중에 미더덕 낭액에는 소화액 뿐만 아니라 매우 다양 한 항산화물질이 존재함이 발견되었다. 미더덕은 우렁쉥이과 에 속하는 해양생물로, 우렁쉥이와 유사한 특성을 지니고 있 다. 우렁쉥이에는 다양한 카르티노이드 색소가 존재18,19)하며 특히 alloxanthin을 비롯한 xanthin계 카르티노이드가 많이 함 유되어 있다20). 이러한 카르티노이드는 산화 반응에 있어서 활성산소에 대한 강력한 소거제로 작용하여 자유라디칼 반응 억제로 세포와 조직을 보호하는 중요한 역할을 하며 강력한 항산화제로 동물의 번식촉진, 성장률 개선, 질병 발생의 억제 등 유용한 기능성을 나타내는 것으로 알려지고 있다21). 따라 서, 본 연구에서는 해양생물자원인 미더덕 낭액 속에서 카르 티노이드계 성분들을 조사하였으며, 이들의 생화학적인 특징 을 연구하였고, 그 밖에 미더덕 낭액이 가지고 있는 생리 활성 물질에 대하여 연구하였다.
Ⅱ.MATERIALS and METHODS
1.실험재료 및 시약
본 실험에서 사용한 미더덕은 경상남도 마산시 진동면 광 암 마을의 인근에서 채취하였으며, 이 물질을 제거하고 물로 깨끗이 여러 번 씻은 후 사용하였다. 낭액은 주사기를 이용하 여 추출한 다음, 원심분리 (18,000rpm, 4℃, 20min)하여 불순 물을 제거한 후에 상층액을 회수하여 순수한 낭액으로 사용 하였다 (Fig. 1). 항산화 정도를 측정하기 위해 사용된 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)와 ABTS (2,2-azinobis-3- ethybenzthiazdine–6-sulphonic acid, Sigma-Aldrich, Mo, USA) 를 사용하였다. Ascorbic acid, DEME medium, phosphate buffer, SP 및 Q resin 등은 모두 일급시약으로 사용하였다.
1)미더덕 낭의 조직관찰
미더덕의 이물질을 제거하고 물로 깨끗이 여러 번 씻은 후 낭액을 제거하지 않은 채 그대로 10% 포르말린에 고정하여 사용하였으며, 통법에 의하여 파라핀 블록을 제작하였다. 미더덕의 조직을 4μm 두께의 현미경 조직박편을 제작하고 hematoxyline & eosin 및 Masson-trichrome염색22)을 한 다음 광학현미경 촬영 장치 (Olympus DP-70)로 디지털 영상을 얻었다.
2)미더덕 낭액의 크로마토그래피 분석
①이온교환 컬럼 분석
순수한 낭액을 얻기 위해 원심분리 (18,000rpm, 4℃, 20min) 하여 불순물을 제거한 뒤 상층액을 회수하였다. 미더 덕 낭액에는 양이온과 음이온성 물질들이 있는데 이를 분리하 기 위해서 SP (Sepharose™Fast Flow)와 Q (Sepharose™ FastFlow) 레진 (resin)을 사용하였다. 이는 양이온(cation) 교 환과 음이온 (anion) 교환으로 미더덕 낭액의 양이온을 분리 하기 위해서는 SP(-) Resin을 사용하며, 음이온을 분리하기 위 해서는 Q(+) resin을 사용하였다. 각각의 비드 (bead)에 SP(-) resin과 Q(+) resin을 넣어 비드를 채우고, 불순물을 제거한 미더덕 낭액의 원액을 각각의 비드에 반응시켰다. SP(-)는 양 이온을 Q(+)는 음이온을 분리시킨 상태에서 비드 속 불순물 을 PBS로 3번 반복하여 세척한 뒤 1.5M NaCl (pH3.0) 용액으 로 결합되어 있는 이온들을 용리시켰다. SP(-) 비드에서는 양 이온성 물질을, 그리고 Q(+) 비드에서는 음이온성 물질을 얻 었다. 또한 미더덕 낭액에 있는 염분을 없애기 위해 투석 (dialysis) 법을 이용하여 염분을 걸러낸 뒤 동결건조기 (Freeze Dryer, 제이오텍, KR/FO-60M)로 24시간 동안 완전히 건조시킨 후에 분말로 만들었다 (Fig. 2).
②겔 여과 크로마토그래피와 C18 컬럼을 이용한 HPLC 분석
이온교환 컬럼으로 물질을 분리를 한 후 동결건조기로 건 조시킨 분말을 3차 증류수로 희석하여 겔 여과 크로마토그래 피와 HPLC 분석을 하였다. 겔 여과 크로마토그래피의 컬럼은 superposeTM12 column (10mm/300mmGL, Pharmacia, USA) 를 사용하였고, 이온 컬럼으로 분리한 SP(-)와 Q(+) resin들에 서 얻은 물질과 50%의 미더덕 낭액을 각각 70μL 주입 하였다. 이동상 액체로는 potassuim phosphate buffer (20mM KH2 PO4-K2HPO4, pH6.9)을 사용하였고, UV280에서 0.3mL/min의 속도로 유동시켰다. HPLC 분석에도 이온교환 컬럼으로 분리 한 SP(-)와 Q(+) resin에서 얻은 물질과 50%의 미더덕 낭액을 각각 10μL 주입하였고, HPLC 컬럼은 C18 컬럼 (BONDAPAK ™C18, Waters, USA)을 이용하였으며 이동상 액체로 acetonitrile (pH6.6)을 0.5mL/min 속도로 분리하였다.
3)미더덕 낭액의 UV스펙트럼 흡수성 분석
순수한 낭액을 얻기 위해 원심분리 (18,000rpm, 4℃, 20min)하여 불순물을 제거한 후에 상층액을 회수하였다. 전 체 미더덕 낭액과 앞 단계 2)에서 실험한 SP(-)와 Q(+) resin을 통해 얻은 물질을 UV스펙트럼으로 자외선 파장 범위에 속하 는 200~400nm까지를 스캔하여 미더덕 낭액이 갖는 자외선 파장흡수성에 관한 분석을 하였다 (Fig. 2).
4)미더덕 낭액의 항균효과
순수한 낭액을 얻기 위해 원심분리 (18,000rpm, 4℃, 20min) 하여 불순물을 제거한 후에 상층액을 회수하였다. 미더덕 낭액 의 항균효과를 측정하기 위해서 Bacteria Killing Assay (BKA) 로 분석하였다. 대장균 (Escherichia coli, E. coli)은 한국종균협 회로부터 분양 받아 사용하였다. 대장균을 LB 배지 (10g tryptone, 5g yeast extract, 5g NaCl, 1mL 1M NaOH)에 넣고 배양기에서 37℃, 24시간 동안 배양한 뒤 OD600 값에서 측정하 여 0.3~0.5 값 정도로 배양되었을 때 대장균을 희석하여 1×103 cells/μL 까지 만들었다. 준비된 미더덕 낭액과 대장균을 배양 조건에 따라 LB배지 (10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride, 15g agar)에 도말하여 37℃ 배양기에 24시간 동안 배양한 결과를 Table 1에 표시하였다.
5)미더덕 낭액의 항산화효과
①DPPH 라디칼 소거능
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼소거능은 Lee 등23)의 방법에 준하여 100% 미더덕 낭액의 원액 100μL와 2배 로 희석한 미더덕 낭액 100μL에 4.1×10-5 M의 DPPH용액 900 μL를 첨가한 후 517nm에서 반응시간 1분부터 5분 간격으로 30분까지의 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 강한 항산화 제인 ascorbic acid를 각각 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40ppm의 농도로 만들어서 비교하였다.
②ABTS 라디칼 소거능
ABTS (2,2-azinobis-3-ethybenzthiazdine-6-sulphonic acid) 라디칼 소거능은 ABTS+cation decolorization assay 방법으로 확인하였다10). 최종농도 7.4 mM의 ABTS와 2.6 mM potassium persulfate로 혼합한 후 암실에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+를 형성시키고 732nm에서 흡광도 값이 1.4~1.5가 되 도록 phosphate buffered saline (PBS, pH7.4)으로 희석하였 다. 희석된 ABTS 용액 950μL에 미더덕 낭액원액을 50μL와 2배로 희석한 미더덕 낭액 50μL를 각각 첨가한 후 732nm에서 1분부터 1분 간격으로 10분까지의 흡광도를 측정하였다. 대 조군으로는 강한 항산화제인 ascorbic acid를 각각 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40ppm의 농도로 만들어서 사용하였다. DPPH 라 디칼 소거능과 ABTS 라디칼 소거능은 아래의 식으로 계산하 여 백분율 (%)로 나타내었다.
③Phenyl nitroacetate (PNA) 측정
미더덕 낭액의 원액과 앞 단계 2)에서 실험한 SP(-)와 Q(+) resin을 이용하여 최종적으로 얻은 물질을 phenyl nitroacetate (PNA)와 반응시켜 400nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 용액에 있는 활성산소들의 촉매작용에 의해 PNA가 치환반응 을 일으키면서 PNA의 페닐링에 이중결합이 형성되고, 무색의 용액이 노란색으로 바뀌며 400nm에서 흡광도가 증가하는 원 리를 이용하였다. 이 반응에서 수치가 낮을수록 강한 항산화 효과를 나타낸다.
6)미더덕 낭액의 항암효과
순수한 낭액을 얻기 위해 원심분리 (18,000rpm, 4℃, 20min)하여 불순물을 제거하고 상층액을 회수한 다음 filter (0.20μm, DISMIC-25)로 한 번 더 불순물과 세균을 제거한 뒤 사용하였다.
①암세포 배양 및 조건
본 실험에 사용한 암세포주는 사람 위암 유래의 세포인 SNU-1 (human gastric cancer cell) 세포로 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 실험에 사용하였다. 세포 배양을 위한 배지는 SNU-1 세포주의 경우 DMEM 배지를 사 용하였다. DMEM 배지에 10% FBS (fetal bovine serum) 50mL과 P/S (penicillin/streptomycin) 10mL을 첨가하였다. 대조군으로는 배지 20mL에 SNU-1세포 1×107개를 넣었고, 실 험군으로는 배지 20mL에 SNU-1세포 1×107개와 100% 미더덕 낭액, 앞 단계 2)에서 실험한 SP(-)와 Q(+) resin을 통해 얻은 물질 (Fig. 2)을 각각 2mL씩 암세포에 분주하여 37℃에서 6시 간 또는 24시간 동안 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
②암세포 성장억제 효과측정
6시간 또는 24시간이 지난 대조군과 실험군을 50mL 튜브 에 모아 원심분리 (18,000rpm, 4℃, 20min)하여 상층액 (배 지)을 제거한 뒤 암세포만 모아 70% 알코올을 넣어 3~4시간 동안 고정하였다. 세포 고정 후 원심분리 (18,000rpm, 4℃, 20min)하여 상층액 (알코올)을 제거하고, FACS buffer (1.0 mM disodium EDTA, 1.9 mM potassium phosphate, 3.8 mM potassium chloride, 16.6 mM sodium phosphate, 139.0 mM sodium chloride) 1 mL에 PI (propidium iodide) 5μL 넣어 염색을 한 뒤 Flowcytometry (Scharff, Pharmacia, USA)를 사 용하여 암세포 성장 억제효과를 측정하였다.
Ⅲ.RESULTS
1.미더덕 낭의 조직관찰
미더덕 낭에는 아포크린 유형 (apocrine type)의 분비선이 다량 분포되어 있으며 각각의 분비선에는 사람의 침샘과 유사 하게 효소원과립 (zymogengranule)들이 풍부하게 관찰되었 다. 미더덕낭에 발달 되어있는 분비선은 사람의 침샘에서 관 찰되는 분비선으로 도관구조가 없고 선세포들에서 분비된 분 비액이 소포 (acinus)에 모였다가 바로 미더덕 낭 내부로 분비 되는 형태로 관찰되었다 (Fig. 3). 따라서 미더덕 낭에 발달된 분비선은 사람의 피지선과 유사한 아포크린 (apocrine) 형태 의 선 조직으로 이루어 져서 미더덕 낭액이 단시간 내에 다량 의 분비액을 배출시킬 수 있는 구조로 여겨지며 미더덕 낭액 에는 바닷물에 포함되어 있는 여러 종류의 플랑크톤들과 함께 매우 다양한 미더덕 낭의 분비물질이 포함되어 있었다.
2.미더덕 낭액의 크로마토그래피분석
1)이온교환 컬럼분리
미더덕 낭액의 다양한 물질을 분석하기 위해 이온교환 컬 럼으로 SP(-)와 Q(+) resin을 이용하였다. Fig. 4에서 나타낸 것과 같이 SP(-) resin에서는 양이온성 물질을 Q(+) resin에서 는 음이온성 물질을 얻었다.
2)겔 여과 크로마토그래피와 C18 컬럼을 이용한 HPLC 분석
50% 미더덕 낭액과 Fig. 4에서 분리한 SP(-)와 Q(+) resin에 서 얻은 물질로 겔 여과크로마트그래피를 한 결과, 50% 미더 덕 낭액에서 120~180분 사이에 각각 3개의 피크가 나타났다 (Fig. 5). 또한 Q(+) resin에 의해 분리된 음이온성 물질에서는 60~80분 사이에 큰 피크 1개와 100분 이상의 시간에서 다른 몇 가지 피크가 보였다. 하지만 50% 미더덕 낭액에서 보인 피크와 양의 차이가 있지만 시간대와 피크형태가 유사하였다. SP(-) resin에 의해 분리 된 양이온성 물질에서는 0~20분에 큰 피크 1개와 40~60분에 작은 피크 1개가 보였고, 100분 이상에 서 보여진 피크 역시 Q(+) resin에서 나온 물질과 마찬가지로 50% 미더덕 낭액에서 보인 피크와 형태가 유사하였다. HPLC 분석에서는 50% 미더덕 낭액에서 2개의 피크가 나타났다. Q(+) resin에 의해 분리된 음이온성 물질에서는 피크 4개의 피크가, SP(-) resin에 의해 분리된 양이온성 물질에서는 2개 의 피크로 각각 분리되었다 (Fig. 5).
3.미더덕 낭액의 UV 스펙트럼 흡수성 분석
앞 단계 ②에서 실험한 SP(-)와 Q(+) resin을 이용하여 분리 후 최종적으로 얻은 물질로 UV스펙트럼을 실시한 결과, 전체 미더덕 낭액에는 210nm에서부터 290nm사이에 4개의 피크가 보였고 300nm 이상에서는 피크가 없었다. Q(+) resin에 의해 분리된 음이온성 물질에서는 230nm에서 280nm사이에 3개의 피크가 나타났다. SP(-) resin에 의해 분리된 양이온성 물질은 220nm에서 270nm사이에 2개의 피크를 보였다 (Fig. 6). 따라 서 미더덕 낭액에는 중요한 UV광선의 흡수성이 있음을 알 수 있었다. 우렁쉥이에는 다양한 카르티노이드 색소가 존재하며 18,19,24), 특히, alloxanthin을 비롯한 xanthin계 카르티노이드가 많이 함유되어 있다20). 우렁쉥이와 유사한 미더덕의 카르티노 이드 조성에 관한 연구에서도 껍질과 근육에 카르티노이드 성 분인 cynthiaxanthin (27.4%, 26.5%), halocynthia xanthin (15.1%, 16.2%), β-carotene (9.9%, 17.5%), diatoanthin (8.4%, 6.6%) 등의 순서로 카르티노이드 성분을 함유하고 있 었다25). 따라서, 미더덕 낭액에서 나타난 피크 성분도 카르티 노이드계 물질로 추측되며, 이것으로 인해 강한 항산화력을 나타내는 것으로 추측 된다.
4.미더덕 낭액의 항균효과
미더덕 낭액의 항균작용을 알아보기 위해서 Bacteria Killing Assay (BKA)를 수행하였다. 미더덕 낭액의 농도에 따른 항균 효과를 조사하였지만 큰 차이가 없었다 (Fig. 7, Table 1).
5.미더덕 낭액의 항산화효과
미더덕 낭액의 항산화 특성을 분석하기 위해서 가장 널리 이용되는 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)와 ABTS (2,2- azinobis-3-ethybenzthi azdine-6-sulphonic acid)를 사용해서 미더덕 낭액의 라디칼 소거능을 측정하였다. 그리고 Phenyl nitroacetate (PNA)를 이용하여 미더덕 낭액 처리 후에 용액 내에 잔존되어 있는 자유라디칼의 농도를 측정하여 미더덕 낭 액에 포함되어 있는 음이온성 물질과 양이온성 물질의 항산화 효과를 비교하였다. DPPH 라디칼 소거능은 tocopherol이나 ascorbic acid 같은 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 환원되 어 짙은 보라색이 되면서 안정한 화합물로 변화하여 노란색을 띄게 되며, ABTS 라디칼 소거능 역시 항산화 활성이 있는 물 질과 만나면 청록색이 수산기 (–OH)에 의해 안정화되어 무색 을 띄게 된다. DPPH 라디칼 소거능 경우 30분 정도면 반응이 완료되는 반면에, ABTS 라디칼 소거능은 5~10분이면 반응이 완료되므로 DPPH 라디칼 소거능에 비해 반응시간이 짧아 빠 른 시간에 항산화 효과를 확인할 수 있었다. 이에 비해서 PNA 에서는 자유라디칼의 촉매작용으로 생기는 치환반응의 결과 를 이용해서 비교적 정확하게 미더덕 낭액의 항산화 효과를 측정하였다.
1)DPPH 라디칼 소거능 측정
대조군으로 ascorbic acid를 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40ppm의 농도로 조제하여 517nm에서 흡광도를 측정한 결과를 Fig. 8과 Table 2에 나타내었다. 100% 미더덕 낭액의 항산화능은 대조 군 ascorbic acid 농도의 약 25~30ppm에 해당 하였으며, 이를 백분율로 환산하면 동일한 농도의 미더덕 낭액의 항산화능이 동일한 농도의 ascorbic acid 항산화능의 61%가 된다. 50% 희석한 미더덕 낭액의 항산화능은 대조군 ascorbic acid 농도의 약15~20ppm이며, 이를 백분율로 환산하면 동일한 농도의 미 더덕 낭액의 항산화능이 동일한 농도의 ascorbic acid 항산화 능의 42%를 나타냈다 (Fig. 8, Table 2). 일반적으로 미더덕은 날 것보다는 익힌 것을 주로 먹기 때문에 미더덕 낭액을 1시간 동안 가열한 뒤 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다. 그 결과, 가열하지 않은 100% 미더덕 낭액보다 가열한 미더덕 낭액에서 더 강한 항산화 활성을 보였다 (Fig. 9, Table 3).
2)ABTS 라디칼 소거능 측정
대조군으로 ascorbic acid를 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40ppm 의 농도로 조제하여 732nm에서 흡광도를 측정한 결과를 Fig. 10과 Table 4에 나타내었다. 100% 미더덕 낭액의 항산화능은 대조군 ascorbic acid 농도 약 25~30ppm에 해당하였으며, 이 를 백분율로 환산하면 동일한 농도의 미더덕 낭액의 항산화능 이 동일한 농도의 ascorbic acid 항산화능의 40%가 된다. 50% 희석한 미더덕 낭액의 항산화능은 대조군 ascorbic acid 농도 약 15~20ppm에 해당하였으며, 이를 동일한 농도의 미더덕 낭 액의 항산화능이 동일한 농도의 ascorbic acid 항산화 능의 24%를 나타냈다 (Fig. 10, Table 4).
3)Phenyl nitroacetate (PNA) 측정
Phenyl nitroacetate (PNA)는 DPPH와 ABTS와는 달리 잔존 된 자유라디칼을 확인하는 방법으로 전체 미더덕 낭액과 앞 단계 2)에서 실험한 SP(-)와 Q(+) resin 이용하여 분리한 후에 최종적으로 얻은 양이온성과 음이온성 물질들을 PNA 반응 후 에 400nm에서 흡광도를 측정한 결과, 용액 내의 자유라디칼의 양이 클수록 높은 흡광도를 보였는데, 100% 미더덕 낭액의 흡광도 값 0.762±0.078를 대조군으로 사용하여, SP(-) resin에 의해 분리된 양이온성 물질의 값 0.473±0.007를, Q(+) resin에 의해 분리된 음이온성 물질의 값 0.527±0.011을 비교하였다. 그러므로 100% 미더덕 낭액에 비해서 음이온성 물질과 양이온 성 물질에서 모두 강한 항산화효과를 보였으며, 음이온성 물질 보다 양이온성 물질이 더 큰 항산화효과를 보였다 (Fig. 11).
6.미더덕 낭액의 항암효과
SNU-1 암세포에서 미더덕 낭액의 항암효과를 flow cytometry 에 의해 분석한 결과, 대조군-1은 2n 염색체군(diploid chromosome) 에서 뚜렷한 피크를 보였다. 100% 미더덕 낭액을 6시간 동안 단기간 투여한 것은 실험군에서 대조군보다 세포사멸이 증가되 었다. 대조군-2에서도 2n의 세포수가 증가되었는데, 100% 미더 덕 낭액을 24시간 동안 장기간 투여한 후에 flow cytometry에서 측정한 세포 값이 13,485±235 cells/100sec이었다. 한편, Q(+) resin에서 분리한 음이온성 물질을 처리한 것은 세포사멸이 증가되어서 측정값은 11,685±372 cells/100sec으로 대조군-2보 다 SNU-1 세포의 수가 현저하게 감소되었다 (Fig. 12). SP(-) resin에서 분리한 양이온성물질을 처리한 것은 세포의 측정값이 9,270±157 cells/100sec 으로 가장 적었다. 따라서 미더덕 낭액의 양이온성 물질이 음이온성 물질보다 더 강한 항암효과를 보였다 (Fig. 13, 14).
Ⅳ.DISCUSSION
미더덕 낭에 발달된 분비선은 사람의 피지선과 유사한 아포 크린 형태의 선 조직으로 이루어진 것으로 관찰되었다. 이러한 아포크린형태의 선 조직은 미더덕 낭액이 단시간 내에 다량의 분비액을 배출시킬 수 있는 구조로 여겨지며 미더덕 낭액에는 바닷물에 포함되어 있는 여러 종류의 플랑크톤들과 함께 다양 한 미더덕 낭의 분비물질이 포함되어 있음을 나타낸다.
바닷물에는 여러 가지 염류와 중금속들이 있으며 많은 자 유라디칼이 존재하기 때문에 바다에 서식하는 생물체는 자신 을 보호하기 위해서 항산화물질을 분비하고 있다. 특히, 우렁 쉥이나 미더덕이 가지고 있는 낭액 성분들은 다른 고등동물의 타액에 비유 될 수 있는데 통상적으로 타액 속에는 항균물질 이 있을 것으로 예상되어 미더덕 낭액 속의 물질을 조사하였 다. 미더덕 낭액을 추출하여 Bacteria Killing Assay (BKA)를 하였는데 낭액의 농도에 따라 항균효과가 있었지만 큰 차이가 없었다. 따라서, 항균력이 약한 이유는 바닷물에는 균이 많지 않기 때문에 항균작용을 할 필요가 없는 것으로 보이며 대신 해 자신의 몸을 보호하는 물질이 있는 것으로 판단하였다.
이차적으로 미더덕 낭액의 항산화특성을 알기 위해 DPPH 와 ABTS 라디칼 소거능을 측정한 결과, 열에 분해되지 않았으 며 ascorbic acid 만큼의 높은 항산화력을 나타내었다. 미더덕 은 플랑크톤을 잡아먹는데 생물체의 활성을 둔화시키고 소화 장기를 바닷물의 자유라디칼을 막아 자신을 보호하는 것으로 알려져 있다. 미더덕은 날 것보다는 익힌 것을 주로 먹기 때문 에 미더덕 낭액을 끓인 결과에서도 높은 항산화력이 유지 된 것으로 나타난다. 이러한 미더덕 낭액은 독특한 향기가 있을 뿐 아니라 강한 항산화 물질이 다량 존재하므로 미더덕을 사 람이 식용 할 경우 인체에 매우 유익하고 다양한 작용을 할 것 으로 추측된다.
물질분리의 초기단계에서 양이온성 또는 음이온성으로 분 리하기 위해 이온교환 컬럼으로 SP(-)와 Q(+) resin을 이용하여 분리한 결과, 전체 미더덕 낭액에서 네 종류의 뚜렷한 물질이 관찰되었고, SP(-) resin에서 두 종류, Q(+) resin에서 세 종류 의 물질이 관찰되었다. 기존 연구를 바탕으로 멍게과 우렁쉥이 에는 다양한 카르티노이드 색소가 존재하며 특히 alloxanthin 을 비롯한 xanthin계 카르티노이드를 함유하고 있는 것으로 밝혀져 있으며 이러한 카르티노이드 성분 때문에 우렁쉥이나 미더덕에도 강한 항산화작용을 하는 것으로 보인다.
미더덕 낭액의 항암효과는 flow cytometry에 의해 성장 억제 효과를 측정하였다. 대조군과 비교하여 전체 미더덕 낭액에서 항암효과를 보였지만, SP(-)와 Q(+) resin을 이용하여 분리한 물질 중 에서는 SP(-) resin에 의해 분리한 양이온성 물질에서 항암효과가 더욱 높게 나타났다. 이는 phenyl nitroacetate 측정 에서도 활성산소를 제거 할 수 있는 능력이 큰 물질이었다.
미더덕 낭액은 가열했을 때 항산화력이 더 높은 결과를 얻 었는데 이전 논문에서 미더덕 껍질과 근육에 카르티노이드계 물질 중 cynthiaxnthin 함량이 제일 많은 것으로 밝혀져 있다 28). Cynthiaxnthin의 분자구조는 이중결합 및 삼중결합을 하 고 있어 UV광선을 흡수 할 수 있는 것으로 추측된다. 이는 해양환경에 강한 UV광선으로부터 자신을 보호 할 수 있는 능 력을 나타낸다. 따라서, 카르티노이드계로 추측되는 물질이 있어 강한 항산화력을 나타내는 것으로 추측되며, 미더덕 낭 액은 ascorbic acid의 25~30ppm 정도의 높은 항산화력을 나 타내며, 미더덕 낭액의 농도와 같은 농도의 ascorbic acid의 약 24%의 항상화력을 보였다. 한편, 미더덕 낭액은 가열 시에 도 지속적인 항산화 효과를 보이므로 열에 의해 분해되기 쉬 운 ascorbic acid 보다 미더덕 낭액의 카르티노이드 성분을 활 용하는 것이 보다 유리해서 향후에 미더덕 낭액의 카르티노이 드 성분을 추출하여 식품, 화장품 등의 부소재로 활용 할 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 강한 항산화성을 보이는 미더덕 낭액을 미 세여과를 통하여 불순물과 세균을 제거한 후에 SNU-1 세포배 양에 투여하였으며, 특히 SP(-)와 Q(+) resin을 이용한 컬럼을 사용해서 얻은 anionic 낭액과 cationic 낭액을 분리해서 동일 한 방법으로 SNU-1 세포배양에 투여하였다. 결과적으로 미더 덕 낭액을 6시간 동안 단기간 투여한 경우에는 SNU-1 암세포 에서 세포자멸사가 크게 증가하였으며, 24시간 동안 비교적 장기간 투여한 경우에는 남아 있는 SNU-1 암세포의 수가 크 게 감소하였다. 이는 미더덕 낭액은 강한 항산화능이 있을 뿐 아니라 암세포를 세포자멸사 시켜는 항암기능이 있음을 나타 낸다. 비록 본 연구에서는 미더덕 낭액 성분에 대한 초보적인 특성연구이지만 미더덕 낭액이 사람에서 중요하게 작용하는 ascorbic acid에 필적할 수 있는 항산화능이 있으며 사람의 암 세포에 대하여 강한 항암작용을 하는 것은 매우 의미 있는 결 과이다. 따라서 향후에 미더덕 낭액에 대한 보다 심도 깊은 연구가 필요할 것으로 생각된다.
