Ⅰ.INTRODUCTION
치수 감염을 일으키는 원인 균주는 배양법과 검출 방법의 발달에 의해 현재까지도 서서히 밝혀지고 있다. 보통 구강에 는 그람 양성균이 주요 정상 세균총을 이루고 있으나 치주질 환이 진행됨에 따라 혐기성 그람 음성균의 비율이 급속히 증 가하는 것으로 알려져 있기 때문에 혐기성 세균의 비율이 증 가하는 것은 치수 괴사의 중요한 변화라고 할 수 있겠다1). 근 래의 실험에서도 괴사된 치수 조직 내에 혐기성 세균은 같은 치수에서 배양해 낸 전체 균종 중 70~95%를 차지하는 것으로 나타났다2). 급성 치근단 치주염이나 급성 치근단 농양의 발병 에도 중요한 역할을 하는 심각한 증상의 치수 감염은, 일차적 치수 감염에서도 발견되는 Treponema denticola(T. denticola)3,4), Porphyromonas gingivalis(P. gingivalis)3,4), Fusobacterium nucleatum(F. nucleatum)3,5), Prevotella intermedia(P. intermedia)3,6), Streptococcus mutans(S. mutans)7), Staphylococcus aureus(S. aureus)8)를 포함한 다양한 절대 혐기성 세균들과 주로 관련이 있었다3,4). 구강 내 Spirochetes 중 하나인 T. denticola는 특히 치수 감염과 관련된 균주이며, 급성 치수염의 거의 모든 경우 에서 T. denticola가 발견된다1). 또다른 구취 유발 세균인 F. nucleatum는 감염된 근관 내에서 주로 발견되며, 다시 재발하 는 경향에 대한 연구에 의하면 재발된 근관의 균종의 33.3%에 서 F. nucleatum의 존재가 확인되었다9). 치수 내 감염을 진단 하기 위해서는 여러 가지 미생물 검출 방법을 사용할 수 있다 6,8). PCR(polymerase chain reaction) 분석은 세균 배양법이나 세균 배양 후 시행하는 생화학적, 면역학적, 유전학적 방법에 비해 매우 간단하면서 시간이 절약되고 감도가 높아 특이성, 정확성, 효율성이 높으며, 응용범위가 넓어 현대 생명과학에 서 가장 중요한 기술 중에 하나로 손꼽혔다10). 최근에는 미생 물의 유무만을 확인하는 이전의 PCR 분석에서 좀 더 발전하 여 치수 감염의 임상 시료로부터 추정 미생물 병원체를 정량 적으로 찾아내는 qPCR(quantitative PCR) 분석이 사용되고 있 다11). Multiplex PCR 분석은 1980년대에 처음으로 보고된 후 로 돌연변이 분석, 다중 형질분석, 정량분석, RNA 검출 등 핵 산을 이용한 진단법에 널리 사용되어 왔다. Multiplex PCR 분 석을 위한 모든 primer는 각각의 표적에 대한 증폭 효율성이 유사하여야 한다. 즉 primer들의 최적 GC 함량을 지님은 물론 거의 동일한 primer 결합온도를 가지며 primer 자체 내에 또 는 이들 primer 사이에 염기서열의 유사성 및 상보적 결합이 적어야 한다12). 본 연구에서 이용한 종-특이적 primer는 Primer 3 소프트웨어를 사용하여 상당히 세심하게 디자인 되 었다(version 0.3.0; Whitehead Institute and Howard Hughes Medical Institute, USA). Multiplex qPCR 분석은 단 하나의 qPCR 분석 기구만을 이용하면서도 동시에 여러 표적을 증폭 하고 검출할 수 있으며, 하나의 실험 플레이트를 시행하는데 약 한 시간 정도의 시간만 소요되므로 임상 표본의 진단에 필 요한 비용과 시간을 최소한으로 할 수 있다. 이 연구의 목적은 일차적 치수 감염과 관련된 6개의 주요 원인 균주들을 단일 반응으로 동시에 빠르게 검출하고 미생물동정까지 이루어지 도록 새로운 primer를 디자인하고 이를 바탕으로 효율적인 multiplex qPCR 분석 방법을 확립하는 것이다.
Ⅱ.MATERIALS and METHODS
1.표준 균주 대상 실험
1)사용 균주 및 배양 조건
이 연구에서 사용된 미생물 균주는 한국 구강미생물 자원 은행(서울대학교)으로부터 분양받았다; T. denticola ATCC 33520, P. gingivalis ATCC 33277, F. nucleatum ATCC 25586, P. intermedia ATCC 25611, S. mutans KCTC 3283, S. aureus ATCC 29213. DNA 추출을 위하여 균주들은 표준 배양법에서 사용하는 brain-heart infusion(BHI)으로 37℃에서 혐기적 조 건(10% H2, 10% CO2, 80% N2)으로 배양하였다13). 위의 혐기 성 세균 균종 6가지는 기존에 치수 감염과 밀접한 관계가 있 다고 보고된 많은 세균들 중, 일차적 치수 감염과 그로 인한 치주질환의 원인이 되는 균주이다(Table 1).
2)DNA의 추출
유전체 DNA는 High Pure PCR Template Preparation Kit(Roche, Basel, Switzerland)를 이용하여 제조회사의 지시 에 따라 배양한 세균으로부터 추출하였다(Fig. 1).
3)DNA의 순도와 농도 측정
본 연구에서 사용된 추출 DNA의 순도와 농도는 ND-1000 분광 광도계(NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, NC, USA)를 사용하여 측정하였다. DNA를 이용한 다양한 실험을 위해서 시료로부터 DNA를 추출하는데, 추출된 DNA의 양 (yield)과 순도(purity)는 이후 수행될 여러 가지 실험의 성패 를 좌우하는 중요한 요소가 된다. DNA의 농도는 분광광도계 로 260 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하는데, 그 값이 1일 때 이중 가닥 DNA 농도가 50 ng/㎕ H2O 인 것으로 하여 계산 하였다. 정확한 측정을 위하여 A260 값은 0.1~1.0 사이 범위 에서 측정되는 것이 좋으며, 이를 위하여 측정될 DNA 원액을 필요에 따라 TE 완충액(pH 8.0)으로 적절하게 희석하여 흡광 도를 측정하였다. DNA의 순도는 260 nm의 흡광도 값을 280 nm 또는 230 nm값의 비율로 결정한다. 흡광도 값을 280 nm 비율로 측정하는 경우, A260/A280 ratio = 1.8~2.0일 때 순도 가 좋다고 판단한다. 만약 값이 낮은 경우, DNA의 농도가 너 무 낮거나 단백질 오염을 의심해야 하며, DNA가 녹아있는 용 액의 pH가 낮은 경우에도 값이 낮아질 수 있다. 반면에 흡광 도 값을 230 nm로 결정한 경우, A260/230 ratio = 2.0~2.2 일 때 순도가 좋다고 결정한다. 이 비율에서도 낮은 값은 오염 물질이 혼합되어있기 때문이며, DNA 추출 과정에서 사용하 기도 하는 phenol이나 guanidine DL, glycogen 등의 성분들 이 남아있는 경우를 의심해보아야 한다.
4)Primer 디자인
한 종에만 국한된 primer는 Primer 3 소프트웨어의 사용으 로 설계되었다(version 0.3.0; Whitehead Institute and Howard Hughes Medical Institute, USA). T. denticola, P. gingivalis, F. nucleatum, P. intermedia에 대한 새로운 종 특이 적 primer는 이 연구에서 디자인되었다. S. mutans, S. aureus 와 두 개의 항존유전자(16s rRNA)에 대한 종 특이적 primer는 기존의 문헌을 기초로 설계하였다14,15). (Table 2). Primer는 multiplex qPCR 분석용으로 Xenotech(Daejeon, Republic of Korea)를 이용해 합성하였다.
5)정량적 중합효소 연쇄 반응 분석
16S rRNA 유전자적중 multiplex qPCR 분석은 CFX 96 RT Detection System(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)을 사용한 SYBR Green법으로 실행하였다(Fig. 2). qPCR 혼합물에는 주형 DNA 5 ㎕와 2×iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad Laboratories Inc.) 12.5 ㎕, 각 primer 1.0 ㎕, 그리고 최종 부피가 20 ㎕가 될 때까지 부어준 탈염증류수 가 포함되어있다. 주형 DNA의 비교대조군(음성대조군)은 같 은 부피의 ddH2O로 대신하였다.
qPCR 분석의 조건은 95℃에서 10분간 initial denaturation 을 시행한 후, 95℃에서 30초간 denaturation, 60℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 30초간 extension 과정을 40 cycle 시행하 였고, 95℃에서 10초간 마지막 extension과정을 진행하였다. 변성곡선 분석은 65℃에서 5초간, 72℃에서 5초간 1회, 이어서 95℃까지 매 1℃씩 증가할 때마다 형광 판독을 시행하였다.
6)자료의 수집과 분석
자료의 수집과 분석은 CFX manager software(version 2.1; Bio-Rad Laboratories Inc.)를 이용하여 시행하였다.
cDNA template를 준비하고 template를 뺀 나머지는 sample 수만큼 혼합하였다. E-tube에 primer와 SYBR Green, DDH2O를 잘 혼합하여 준비해놓고, cDNA template는 PCR tube에 각각 5 ㎕씩 분주하였다. 앞서 준비한 혼합액을 PCR 튜브에 15 ㎕ 씩 추가하여 잘 섞었다. 분석 과정 중에는 90℃ 이상의 온도로 끓기 때문에 증발로 인한 총량의 손실이 발생 할 수 있으므로 Plate를 잘 밀봉한 후 원심분리를 시행하고 real time PCR 분석을 하였다. 96 well plate에 Total volume 은 vial당 20 ㎕를 맞춰주었다.
Ⅲ.RESULTS
1.표준 균주의 DNA 추출
1)DNA의 순도와 농도
DNA의 순도는 자외선을 투사함으로써 흡수한 양을 비교하 여 판정하였다. 본 연구에서 사용된 치수 감염을 일으키는 세 균들 중 T. denticola는 A260/A280의 비율이 1.7, A260/A230은 1.9 로 나타났다. P. gingivalis의 경우 A260/A280는 2.1, A260/A230은 1.8이었고, F. nucleatum은 A260/A280 비율이 2.1, A260/A230 비 율은 1.9로 확인되었다. P. intermedia의 A260/A280 비율은 2.0, A260/A230은 1.8이었고, S. mutans에서 A260/A280 비율은 2.1, A260/A230은 1.7로 나타났으며, S. aureus의 A260/A280은 2.0, A260/A230은 1.8이었다. A260/280 ratio가 1.8~2.0일 때, A260/230 ratio는 2.0~2.2일 때 순도가 높다는 기준을 적용하면 6가지 균종은 A260/280와 A260/230 ratio 모두에서 DNA의 높은 순도를 보여주었으며, 그 중에서도 P. intermedia와 S. aureus는 순도 가 매우 높다고 할 수 있었다.
또한 DNA의 농도는 dsDNA 시료의 양(㎕) × A260에서 흡 광도 측정값 × 희석비율(%)로 계산하여 DNA의 양을 확인 할 수 있었고, 모두 기준 100 이상의 QC control로 진행되어 qPCR 분석 사용에 용이한 결과를 보여주었다(Table 3).
2)새로운 primer의 효율 및 재현성 확인
새로운 primer가 이번 연구에서 의도한대로 정확하게 각 균주룰 검출하고, reference(16s rRNA) 균주와 명확하게 분리 되어 구분할 수 있도록 분석 조건을 확립하는 과정에서 각 균 주별 melting peak을 확인하였다(Fig. 3-8).Fig. 4Fig. 5Fig. 6Fig. 7
T. denticola의 경우, 적은 농도의 실험 시료로 인하여 melting peak의 높이가 작게 나타났고 reference의 melting peak과도 중복되는 양상이 나타나지만 두 균주의 melting peak은 충분히 구분이 가능하기 때문에 분석에는 지장이 없 는 수치라고 판단하였다.
P. gingivalis는 reference의 melting peak과 매우 가까워져 있지만 뚜렷하게 두 개의 melting peak이 나타났고 높은 수준 의 농도에 좌우가 대칭인 P. gingivalis의 melting peak을 확인 할 수 있었다.
F. nucleatum과 P. intermedia는 reference 균주와 비교하여 모두 높은 농도로, 좌우 대칭적인 melting peak이 나타났고 다른 균주들에 비해 넓은 area를 갖는 특징이 확인되었다.
S. mutans의 melting peak은 reference의 melting peak과 상당히 가까워지는 양상이 나타났지만 두 melting peak은 매 우 명확하게 분리되어 있으며 reference보다 높은 농도임을 보여주었다.
S. aureus는 제일 낮은 온도에서 분리되어 나타났고, reference 균주의 melting peak보다 월등히 높은 농도 수준으로 확실히 분리되어 있으며 뚜렷한 좌우 대칭성까지 보여주었다.
이를 종합하여 보았을 때, 새로운 primer를 6가지 균주에 각각 적용한 경우 모든 균주가 명확하게 분리, 검출되어 유의 한 결과들이 나타났고, primer dimer의 형성 없이 디자인된 상태라는 것을 확인할 수 있었다.
3)새로운 primer의 민감성와 유효성
한 종에만 국한된 primer는 용융온도를 구별할 수 있도록 디자인되었고 표본들 중 표준화된 항존유전자(16s rRNA)들은 앞서 표 2에 실렸다. 표본으로부터 얻어진 증폭된 결과물의 변성곡선은 그림 10에서 볼 수 있다(Fig. 9).
새로운 primer는 T. denticola, P. gingivalis, F. nucleatum, P. intermedia에서 각각 매우 높은 특이성을 보여주었다. 표준 균주 여섯 개의 뚜렷한 melting curve의 peak이 명확하게 분 리되어 관찰되었고, 각각 대칭적으로 나타났다. S. aureus의 melting peak이 가장 낮은 용융온도에서 제일 처음 나타났고 그 후 F. nucleatum, P. intermedia, S. mutans, T. denticola, P. gingivalis가 뒤를 이어 차례로 나타났다. 비록 T. denticola 와 P. gingivalis의 melting peak이 중복되는 양상을 보이지만 그 둘의 melting peak은 기준 이상의 농도를 가지고, 충분히 구별 가능할 정도로 분리되어 있었다. 또한 melting peak의 높이가 모두 비슷한 수준에서 형성된 것은 primer에 반응할 수 있는 6개 균주의 농도를 적정 수준으로 맞춰지도록 세심한 계획 하에 분석을 진행한 결과이다. 여기에 6개 균주의 melting peak이 보여주는 뚜렷한 대칭성은 primer의 높은 특 이성까지 보여주는 것이다.
Ⅳ.DISCUSSION
근관 치료의 주목적은 치근관으로부터 치수 감염의 원인 세균을 제거하고 치수 감염이 치근단 치주염으로 발전되는 것 을 예방하는 것이다16,17). 치수 감염은 대부분 혐기성 세균에 의해 발생되며 그람 양성균과 그람 음성균이 비슷하게 분포한 다9). T. denticola는 자발통이 있는 급성 치근단 치주염과 급성 치근단 농양으로 진단받은 각각의 치수에서 54%, 79%씩 검출 되었다4). P. gingivalis와 P. intermedia의 경우에도 감염된 치 근관과 치수 농양에서 비교적 흔하게 검출되고, 그 균종들은 종종 부종, 타진이나 촉진에 의한 동통을 만들어 내는 것으로 나타났다3,6). F. nucleatum은 괴사된 치수의 치근관에서 가장 자주 검출되는 세균들 중 하나이며, 급성 치근단 농양에서 매 우 흔하게 발견된다3,5). S. mutans는 대표적인 치아우식증의 원인 균주이며, 상아세관을 침범하고, 감염된 치근관 안쪽의 상아질 벽을 공격할 수 있는 기회를 만들어주기 때문에 치근 단 치주염의 발병에 있어서 매우 중요한 역할을 한다고 할 수 있겠다7,16).
분자생물학적 방법의 개발은 배양 의존적 방법의 제한점인 낮은 감수성, 까다로운 배양 한계에 대부분을 극복할 수 있게 해 주었고, 치수 내 미생물의 40~55%는 아직까지 배양하지 못한 계통형이라는 것을 확인해 주었다6,8). qPCR 분석은 형광 신호의 탐지를 기초로 한 분석 방법이다. 이러한 형광 신호는 두 가지 대표적인 화학반응, Taqman Probe법과 SYBR Green 법이 발생시킬 수 있다18). SYBR Green 색소는 Taqman probe 법과는 다르게 이중가닥 DNA와 결합하고 유전 특이적 primer의 주도로 표적 증폭 산물의 검출을 가능하게 해주었 다. qPCR 분석은 임상 시료의 독특한 목표 균주에 대한 종 특이적 primer를 이용하여 근관 치료의 효과를 평가하거나 광 범위한 primer로 모든 미생물을 수량화하는데 이용되었다19).
Multiplex PCR 분석은 서로 다른 여러 종류의 목표 균종을 동시에 검출하기 위하여 두 개 또는 그 이상의 특이적 primer 를 단일 반응 tube에서 진행시키는 것이다. 따라서 임상 시료 에서 하나 이상의 중요한 목표 균종을 동시에 증폭시킬 수 있 다20). 설 등20)은 다음 두 가지의 Porphyromonas 균종과 세 가지 Prevotella 균종을 각각 동시 동정하는 multiplex PCR 분 석을 개발하였다. 그러나 multiplex PCR 분석은 증폭 후 분석 을 위한 겔 전기영동을 필요로 하였고 단지 제한적인 수량화 만 제공할 수 있는 이전의 PCR 분석을 기초로 진행하였다. Multiplex qPCR분석은 높은 효율성뿐만 아니라 교차 오염의 위험을 줄이고 임상 시료의 제한적인 수량을 절약할 수 있었 기 때문에 몇몇의 연구원들은 이례적인 세균과 바이러스들을 표적으로 하는 multiplex real-time PCR 분석을 발전시켰다21). 그러나 우리가 확인해 본 바로는 치수 내 미생물을 대상으로 multiplex qPCR 분석을 시행하여 결과를 게재한 연구는 아무 것도 없었다. 이제는 일차적 치수 감염을 일으키는 역동적이 고 복합적인 미생물 군집을 확인할 수 있는 정보를 제공하고, multiplex qPCR 분석을 이용한 진단의 유용성을 입증할만한 더 많은 연구가 필요하다고 생각된다.
본 연구를 진행함에 있어 단일 반응만으로 다중화를 만들 기 위해 primer를 직접 디자인했고, 반응 조건도 최대한 적합 하게 설계하였다. 증폭되는 생산물들의 각각 다른 변성 온도 가 primer의 효율성에 전제조건이었기 때문이다. Primer의 선 택과 디자인은 SYBR Green법을 이용한 성공적인 다중화를 위해서 매우 중요한 과정이었다. 특히 multiplex qPCR 분석에 서, 각 data set들의 중요성은 증폭에 이용한 primer의 특이성 과 기구, 사용자, 그리고 가장 중요한, 방법과 관련된 실험적 인 변동성을 고려하였다. 미생물 동정을 이용한 발전된 진단 법은 multiplex qPCR 분석의 중요성을 극대화시켰다. 또한 primer들은 같은 가열 냉각 온도 이후부터 특정한 증폭 산물 만 생성하던 이전의 primer보다 더 특이적인 것으로 나타났 다. 이번 연구에서 우리는 SYBR Green법을 기초로 하는 multiplex qPCR 분석으로 하나 이상의 치수 내 미생물을 동시 에 동정할 수 있고 검출할 수 있다는 가설을 확인했다.
본 연구에서 multiplex qPCR 분석은 T. denticola, P. gingivalis, F. nucleatum, P. intermedia, S. mutans와 S. aureus 를 동시에 검출하고 빨리 동정할 수 있도록 개발되었다. 변성 곡선 분석과 결합하여 대상 균주들의 수준과 전체 세균의 양 도 확인되었다. 새롭게 개발된 multiplex qPCR 분석은 정확한 임상 진단에 대한 유용함과 일차적인 치수 내 감염과 같은 복 합적인 감염성 질병의 원인을 증명하기 위한 실험실의 개선된 접근성을 제공할 것이다. 임상에서 이렇게 디자인된 primer를 이용하여 multiplex qPCR 분석을 시행하게 되면 분석에 소요 되는 시간이 짧아져서 세균에 대한 분자생물학적 진단이 빨라 지고 환자에게 빠르고 정확한 진료를 제공할 수 있게 된다. 또한 임상 내에서 새로운 약제의 효과를 정확하고 신속하게 확인하여 항생제의 남용을 방지하고 치료의 예후를 향상시키 는데 기여하게 된다. 이를 위해서 좀 더 다양한 미생물을 대상 으로 하는 새로운 primer가 지속적으로 디자인되어야 하며, 이런 과정의 바탕이 될 수 있는 multiplex qPCR 분석과 Data 확보를 위한 연구들이 더욱 활발히 이루어져야 할 것이라고 생각된다.
