Ⅰ.INTRODUCTION

치주염은 치은, 치주인대, 치조골 등 치아를 지지하는 조직 에 세균성 염증이 생겨 조직 손상을 일으키는 만성 염증성 질 환의 일종으로 초고령화 사회의 도래와 함께 유병률이 급속히 증가하고 있는 질환으로 알려져 있다. 노화와 치주염의 상관 관계는 현재 활발한 논의가 이루어지고 있는 상황이기는 하 나, 65세 이상 고령인구 중 치주염이 없는 인구는 단지 12.5% ~ 13.3%인 것으로 파악되고 있는 것으로 보아 노화가 진행될 수록 치주염이 발병할 확률은 높아질 것으로 예상되고 있다. 이것은 단순한 신체노화뿐만 아니라, 장시간 치주염 유발 위 험인자에 노출된 것이 축적되어 나타나는 연령효과 (age effect)가 더해져서 나타나는 결과로 사료된다^1,2). 치주염은 치 아의 소실을 야기하는 주요 질병인 동시에 치주염-유발 치조 골 흡수 (periodontitis-induced bone resorption)를 수반하는 질병으로 잘 알려져 있다^3,4). 따라서, 치주염 진행과정에서 함 께 일어나는 파골세포 (osteoclast)의 비정상적인 과활성은 치 주염관련 연구의 주요 주제 중 하나로 자리매김해 왔다.

파골세포는 조혈모세포 (hematopoetic stem cell)로부터 기 원하는 대표적인 경조직 파괴세포로서, 전구세포에 해당하는 대식세포 (macrophage)가 receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL) 존재 시 다핵성 파골세포로 분화한다. 분화가 완료된 성숙 파골세포는 생존기간이 12시간 에서 48시간 정도로 매우 짧은데 이는 필요 시에만 정교하게 골흡수를 일으킬 수 있는 주요한 기전으로 작용한다. 따라서, 비정상적인 파골세포의 활성이 관찰되는 골대사성 질환의 경 우 파골세포 분화에 관련된 신호 계의 이상뿐만 아니라, 파골 세포의 생존기간에 변화를 일으킬 수 있는 세포 외 미세환경 에도 주의를 기울일 필요가 있다^5,6).

Connective tissue growth factor (CTGF, CCN2)는 CCN 패 밀리에 속하는 분비성 사이토카인으로서, 발생단계 연골형성 시 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. CTGF는 분자량 이 36~38 kDa 정도인 단량체로 존재하며, 발생단계를 지난 성체에서는 그 발현양이 미미한 것으로 알려져 왔으나, 최근 연구에 의하면 성체에서도 CTGF의 비정상적인 발현이 보고 되고 있다. 성체의 경우 신장의 섬유화 (fibrosis) 혹은 흉터형 성 (scar formation) 시기 CTGF의 높은 발현이 관찰되고 있으 며, 더불어 여러 종류의 암조직에서 과다한 CTGF의 발현이 관찰되는 것으로 알려져 있다. 최근 다수의 연구결과에 의하 면 과발현된 CTGF는 혈관신생 (angiogenesis)을 유발하여 암 전이에 역할을 하는 것으로 확인되었다^7,8).

본 연구에서는 정상 치주조직과 치주염 치주조직에서 그 발현 양이 유의하게 변화하는 신규 사이토카인을 발굴하기 위 해 Gene Expression Omnibus Database (GEO) 탐색을 수행 하였으며 그 결과 정상인 치주조직 40개와 치주염 치주조직 40개의 cDNA microarray 비교분석을 통해 CTGF 사이토카인 의 발현 양이 치주염 치주조직 특이적으로 증가한다는 사실을 확인하였다. 치주염 유발 골흡수와 CTGF의 연관성을 확인하 기 위해 성숙한 파골세포에 CTGF를 처리한 후 세포자멸사 (apoptosis)를 관찰한 결과 CTGF 존재 시 성숙 파골세포의 생존이 크게 증가한다는 사실을 관찰하였다. 이와 같은 결과 를 통해 치주염 조직에서 발현 양이 크게 증가하는 CTGF는 성숙 파골세포의 생존기간을 증가시킴으로써, 치주염 유발 골 흡수의 원인 중 하나로 작용할 수 있다는 사실을 확인하였다.

Ⅱ.MATERIALS and METHODS

1.Macrophage purification and in vitro osteoclast differentiation

5주령 암컷 ICR 마우스의 골수로부터 whole bone marrow 를 획득한 후, ACK buffer를 이용하여 적혈구를 파쇄하고 cell culture dish에 alpha-MEM 배지를 이용하여 37℃, 5% 이산화 탄소 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 바닥에 부착된 세포를 제외한 상층액의 세포만 재취합하여 M-CSF (30 ng/ml)가 존재하는 alpha-MEM 배지에 3일간 추가 배양함 으로써 파골세포로 분화 가능한 대식세포 (macrophage)를 획 득하였다. 위 과정으로 획득한 대식세포를 파골세포 분화유도 배지 (M-CSF 30 ng/ml + RANKL 100 ng/ml, alpha-MEM)를 이용하여 4일간 분화 유도 시킴으로써 성숙한 파골세포를 획 득하여 실험에 사용하였다. 파골세포 분화 유도 후 성숙한 파 골세포의 형성은 tartrate-resistance acid phosphatase (TRAP) 염색을 통해 확인하였으며, 핵이 5개 이상인 TRAP-positive 세포를 파골세포로 간주하였다. 성숙한 파골세포가 80% 이상 인 경우 CTGF를 처리하여 추가적으로 2일간 배양함으로써 CTGF에 의한 성숙파골세포 생존을 대조군과 비교하였으며, 이 경우 M-CSF와 RANKL은 처리하지 않음으로써 CTGF 단독 의 효과를 확인하고자 하였다.

2.Gene Expression Omnibus Database analysis

정상 치주조직과 치주염 치주조직에서 발현 양이 유의하게 변화하는 사이토카인을 발굴하기 위해 NCBI에서 제공하는 데 이터베이스인 GEO를 이용하였다 (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/geo/). 본 연구를 통해 분석한GSE10334 data set은 40명 의 정상인 치주조직과 40명의 치주염환자 치주조직을 분리하 여 Affymetrix사의 Human Genome U133 Plus 2.0 Array 플 램폼을 이용하여 cDNA microarray를 수행한 결과이다.

3.TUNEL assay

성숙 파골세포의 세포자멸사 정도를 정량적으로 측정하기 위하여 terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) 염색을 수행하였다. In Situ Cell Death Detection Kit (Roche)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, FITC가 결합된 1차 항체를 사용함으로써 TUNEL-positive 인 경우 초록색으로 염색되도록 하였다. DAPI염색을 이용하여 성숙 파골세포의 모든 핵을 푸른색으로 염색하여 확인한 후, FITC-positive 핵의 비율을 normalization 함으로써 정량화하 였다.

4.Western blot

성숙 파골세포에 CTGF를 100 ng/ml 농도로 2일간 처리한 후 RIPA buffer (50 mM Tris;pH 8.0, 150 mM NaCl. 1.5 mM MgCl₂, 1mM EGTA, 1% Triton X-100, 10 mM NaF and complete protease inhibitor cocktail) 를 이용하여 단백질을 추출한 후 Bradford assay (Bio-Rad)로 단백질 정량을 수행하 였다. 각 실험군당 40 ng의 단백질을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하였고, PVDF membrane에 transfer 하였다. 5% skim milk에 1시간 반응하여 blocking 한 후 primary antibody (anti-PARP, Santa Cruz Biotechnology)를 4℃ overnight 반응 하였다. HRP가 결합된 secondary antibody를 이용하여 면역 반응을 검출하였고, chemi-luminescence detection kit (Roche)를 통해 측정하였다.

5.Statistical analysis

본 연구에서는 통계분석을 위해 평균과 standard deviation 값을 구한 후 t-test를 통해 유의성을 검증하였다. 통계적 유의 성 평가를 위한 유의 수준은 0.01로 하였다 (*p<0.01).

Ⅲ.RESULTS

치주염의 발병 및 진행에 역할을 하는 새로운 분자타겟을 발굴하기 위해 정상 치주조직과 치주염 치주조직에서 그 발현 양이 유의하게 변화하는 사이토카인을 Gene Expression Omnibus Database를 이용하여 탐색하였다. 본 연구에서는 GEO accession number가 GSE10334 cDNA microarray 결과 를 웹기반 분석 프로그램인 GEO2R을 이용하여 분석하였다. GSE10334 dataset은 미국 콜럼비아 대학의 Demmer RT 연구 팀이 수행하고 2008년 NCBI를 통해 공개된 cDNA microarray 결과로써, 정상 치주조직 40개와 치주염 치주조직 40개의 total RNA를 추출하여 유의하게 변화하는 유전자를 Affymetrix사의 Human Genome U133 Plus 2.0 Array 플램폼 으로 비교 분석한 결과이다⁹⁾. 본 연구에서는 GSE10334의 전 체 초기 결과를 이용하여 정상 치주조직에 비해 치주염 치주 조직에서 발현 양이 높게 증가하는 상위 100개의 유전자를 선별하였고, 그 과정에서 CTGF (connective tissue growth factor)의 발현이 치주염 치주조직에서 크게 증가한다는 사실 을 확인하였다 (Fig. 1). CTGF는 구조적으로 유사한 세 개의 subfamily로 구성된CCN 그룹에 속하는 분비성 기질 단백질 (secreted matricellular protein) 로서 CCN2로 불리기도 한다.

CTGF는 발생시기 연골세포의 분화를 촉진하는 역할이 가장 잘 알려져 있고, 신장의 섬유화 (fibrosis), 흉터형성 (scar formation), 암전이 시 비정상적으로 높은 발현이 보고되고 있 으나, 정상 성인 조직에서는 그 발현 양 이 극미한 것으로 알 려져 있다^7,8). 기존 연구를 통해 여러 종류의 세포에서 CTGF 에 의한 세포증식 변화, 세포분화 변화, 세포주기 조절 변화 등이 보고되었다는 사실에 근거하여 본 연구에서는 치주염과 CTGF 과발현의 상관관계를 확인하기 위해 후속 실험을 진행 하였다.

치주염은 염증성 질환의 일종으로 치주염 유발 골흡수 (periodontitis-induced bone loss)를 수반하여 치조골 소실 등 을 통한 치아 상실을 일으키는 질병이다. 염증성 질환이라는 치주염의 성격으로 인해 필연적으로 다양한 면역반응을 일으 킨다는 사실과 골항상성 (bone homeostasis)이 면역체계와 밀접히 연결되어 있다는 사실을 통해 치주염-골항상성의 상관 관계에 대한 연구는 폭넓게 진행되어 왔다^10,11). 특히 치주염 염증조건에서의 비정상적인 파골세포의 분화촉진 혹은 생존 기간 증가가 치조골 소실의 주요 원인으로 알려져 있으므로 ^12,13), 본 연구에서는 CTGF에 의한 파골세포 생존기간 변화에 대해 실험을 진행하였다.

성숙 파골세포를 획득하기 위해 5주령 ICR 마우스의 골수 로부터 세포를 분리하여 M-CSF (30 ng/ml) 처리를 통해 파골 세포로 분화 가능한 대식세포 (macrophage)로 분화시킨 뒤, 파골세포 분화 유도 배지 (M-CSF 30 ng/ml + RANKL 100 ng/ml)에 대식세포를 배양하였다. 파골세포 분화 유도 후 평 균 3~4일 정도 이후 배양 중인 세포의 80% 이상이 다핵성 TRAP-양성 (multi-nucleated, TRAP-positive) 성숙 파골세포 로 분화되는 것을 확인하였으며 분화유도가 완료된 성숙 파골 세포를 이용하여 CTGF의 효과를 검증하였다 (Fig. 2a). 성숙 파골세포에 두 가지 농도의 CTGF (50 ng/ml, 100 ng/ml)를 처리하여 2일간 배양한 후 파골세포의 세포자멸사를 관찰하 였으며 다른 사이토카인에 의한 효과를 배제하기 위해 M-CSF 와 RANKL은 처리하지 않은 CTGF 단독처리로 실험을 진행하 였다. CTGF를 처리하지 않은 대조군의 성숙 파골세포는 M-CSF/RANKL이 제외된 2일간의 추가 배양 후 약 60%의 세 포에서 세포자멸사 중인 파골세포가 관찰되었다. 이는 성숙 파골세포의 생존기간이 평균 1.3day에 불과하다는 기존 보고 와 일치하였다¹⁴⁾. 하지만 흥미롭게도 CTGF를 처리한 실험군 에서는 파골세포의 세포자멸사가 크게 감소하는 것을 관찰하 였다. 세포자멸사 중인 성숙 파골세포의 비율은 CTGF 50 ng/ml의 경우30 ± 10.14%, CTGF 100 ng/ml의 경 22.6 ± 3.21%로 CTGF의 농도의존적 양상으로 파골세포의 생존이 증 가하였다 (Fig. 2b).

CTGF에 의한 파골세포 생존증가 효과를 다시 한 번 검증하 기 위해 TUNEL 염색 (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling)을 수행하였다. 파골세포의 전체 핵 중 세포자멸사 중인 핵 (TUNEL-positive nuclei)의 비율을 구 하기 위해 전체 핵은 DAPI로 염색하여 TUNEL (green), DAPI (blue)의 이중염색을 수행한 후 세포자멸사 중인 핵의 비율을 정량화 하였다 (Fig. 3a). 그 결과 세포형태로 세포자멸사를 구별한 Fig. 1의 실험과 마찬가지로 세포자멸사 중인 핵의 비 율은 CTGF 0 ng/ml의 경우 62 ± 14.52%, CTGF 50 ng/ml의 경우 22.6 ± 9.6%, CTGF 100 ng/ml의 경우 16.3 ± 11.0%로 나타났다 (Fig. 3b).

PARP (poly ADP-ribose polymerase)는 핵 내에 존재하는 단백질로서 세포가 apoptosis를 일으킬 경우 caspase family 에 의해 cleavage된다는 사실이 잘 알려져 있고 따라서 현재 apoptotic cell marker로 널리 사용되고 있다^15,16). 따라서 본 연구에서는CTGF에 의한 성숙 파골세포 생존 증가 효과를 세 포생화학적 증거로 뒷받침하기 위하여 CTGF 처리 후 PARP cleavage 여부를 western blot analysis로 재확인하였다. 성숙 파골세포에 CTGF를 100 ng/ml 처리하였을 시 그렇지 않은 대조군에 비해 PARP cleavage가 유의미하게 감소하는 것을 확인하였으며 (Fig. 4a), densitometry를 이용하여 정량적으로 분석한 결과 full-length PARP에 비해 0.76 (CTGF 0 ng/ml 그룹)에서 0.25 (CTGF 100 ng/ml 그룹)로 약 0.51 정도 CTGF 에 의한 PARP cleavage 감소를 확인하였다 (Fig. 4b).

Ⅳ.DISCUSSION

본 연구팀은 정상 치주조직에 비해 치주염 치주조직에서 CTGF 사이토카인이 높게 발현한다는 사실을 발견하고, 과발 현된 CTGF가 성숙 파골세포의 생존기간을 증가시킴으로써 치주염 유발 골흡수의 원인 중 하나로 작용할 수 있다는 사실 을 세포수준에서 관찰하였다. 본 연구의 내용과 일치하게도 CTGF가 전신적 파골세포의 분화 및 활성에 영향을 줄 수 있 다는 사실이 최근 연구들을 통해서 보고된 바 있다. CTGF (CCN2) 유전자 결손 마우스는 2003년 처음 확립되었는데, 이 마우스는 성장판 (growth plate)부위에 비정상적으로 비대해 진 hypertrophic cartilage zone이 존재하는 것으로 알려져 있 다¹⁷⁾. 이러한 사실은 연골내골화 (endochondral ossification) 시기 CTGF의 기능적 중요성을 시사해주기도 하지만, 연골조 직이 석회화된 골조직으로 치환되는 replacement 시기에 파 골세포의 활성이 감소되어 있을 가능성을 반증하는 결과이기 도 하다. 위와 같은 사실에 근거하여 일본의 Nishida그룹에서 는 CTGF가 전구 파골세포의 세포 표면에 존재하는 dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP)를 수용체 로 이용하여 DC-STAMP의 세포 표면 발현 자체를 높임으로 전구 파골세포의 융합을 촉진하고 파골세포의 분화를 증가시 킨다는 사실을 보고하였다¹⁸⁾. 또 다른 그룹의 연구에서는 RANKL에 의한 파골세포 분화 과정 중 miR-26a의 발현이 증 가한다는 사실을 확인하고 miR-26a의 타겟 단백질을 탐색하 였는데, 바로 그 타겟이 CTGF라는 사실도 최근 발표된 바 있 다. 즉 파골세포 분화 과정 중 CTGF가 autocrine하게 방출되 는데 이와는 상반되는miR-26a의 발현이 파골세포 분화 후기 에 증가함으로써 CTGF의 활성을 낮추어 결과적으로 정교하 게 조절 가능한 파골세포 분화기전 회로를 형성한다는 내용이 다¹⁹⁾. 종합하자면, CTGF가 파골세포의 분화를 촉진할 수 있 다는 가능성은 여러 연구에서 시사된 바가 있지만, 본 연구에 서는 파골세포 분화가 아닌 성숙 파골세포의 생존에 초점을 맞춤으로써 CTGF가 성숙 파골세포의 생존도 증가시킬 수 있 다는 사실을 관찰하였다. 따라서 치주염 조직에서 CTGF의 발 현이 증가한다면, 파골세포의 분화뿐만 아니라 파골세포의 생 존도 증가하는 결과를 초래하게 되어 치주염 유발 골흡수의 중요한 축으로 작용할 수 있을 것이다.

치과영역에서도 CTGF의 역할이 몇 가지 연구를 통해 보고 된 바가 있다. 특히 약물유도성 치은 과성장 (drug-induced gingival overgrowth)가 발생할 경우 해당 조직에 CTGF가 비 정상적으로 높게 발현된다는 사실은 잘 알려져 있다²⁰⁾. Nifedipine, cyclosporine 과 같은 약물의 부작용으로 치은 과 성장이 나타나게 되는데, 해당 약물은 전신적 TGF-beta의 증 가를 촉발하고, 폐나 신장과 같은 조직에 존재하는 섬유아세 포와 다른 치은 섬유아세포의 독특한 특징으로 인해 치은 섬 유아세포에서 CTGF가 과발현되고 치은 과성장이 발생하게 된다²⁰⁾. 서두에서 강조한 바와 같이 정상 성체에서는 CTGF의 발현이 극미하나 섬유증 (fibrosis), 흉터형성 (scar formation), 종양형성 (tumorigenesis)와 같은 특정 조건에서 CTGF의 높 은 발현이 보고되고 있다. 특히 종양형성 과정 시 CTGF의 발 현이 증가한다는 사실은 염두에 둘 필요가 있다. 치은 과형성 과 구강암은 확연히 성격이 다른 질병이지만, 구강암 주위 섬 유상 조직이 구강암 형성과 전이에 중요한 역할을 한다는 최 근 연구성과들로 미루어 볼 때 치은 과형성 시 발현이 증가하 는 CTGF가 구강암 진행에 역할을 할 가능성은 충분하다고 볼 수 있다.

본 연구를 통해 치주염 조직에서 발현이 증가하는 CTGF 사이토카인이 성숙 파골세포의 세포자멸사를 억제한다는 사 실을 세포형태학적 방법 (Fig. 2), 생물학적 핵표지 방법 (Fig. 3), 세포생화학적 방법 (Fig. 4)으로 검증하였다. CTGF가 파 골세포의 분화를 촉진한다는 기존 연구성과들과 함께 CTGF 가 성숙 파골세포의 생존을 증가시킬 수 있다는 본 연구의 내 용은 치주염 유발 골흡수 기전 이해의 중요한 기반을 제공할 것이며 나아가 치주 연조직/경조직 그리고 구강암 연구에 이 르는 중요한 축을 제시할 수 있을 것이다.