ⅠINTRODUCTION

Human dental pulp stem-like cells (hDPCs)는 치아의 펄 프 조직으로부터 분리 된 성체 줄기 세포로, chondrocytes, adipocytes, endothelial cells, neural progenitor cells, 그리고 myotubes과 같은 여러 세포로 분화가 가능하며, 높은 증식률 과 복구 능력 및 인체의 면역에 대해 낮은 면역반응을 유도한 다^1-2).

hDPCs은 BMP2, HMGB1, NOTCH 및 DLK1과 같은 다수 의 세포 조절인자들을 통해 reparative dentin 형성에 관여할 뿐 아니라 odontoblast로 분화될 수 있음이 보고되고 있다 ^1,3-7). 또한, hDPCs은 in vitro와 in vivo 모델에서 다른 중배엽 유도 줄기 세포 (mesoderm-derived stem cells)와 비교하여 신경 분화 능력이 상대적으로 뛰어나며, hDPCs이 동물 모델 에서 뇌 및 척수 손상에서 치료 효과를 보고함으로서 중추 신 경계 질환 및 상아질 수복의 치료에 대한 잠재성을 보여주고 있다^8-9).

Extracellular nucleotides (퓨린 및 피리미딘)은 세포 내 다 양한 퓨린 수용체 (Purinergic receptors)들을 활성화시키며, 활성화된 Purinoceptor 신호 전달은 세포 내에서 독특한 역할 을 수행하기 위해 다양한 신호 전달 기전을 유도한다. P2X 수용체는 Na⁺, K⁺ 및 Ca²⁺에 대해 세포내 유입을 유도하는 ATP-활성 리간드-양이온 채널 (ATP-activated ligand-gated cationic channels) 이며, P2Y 수용체는 퓨린 및 피리미딘 뉴 클레오타이드 (ATP, ADP, 및 UTP, UDP)에 의해 유도되며, 8 개의 수용체 아형 (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12, P2Y13, P2Y14)을 포함하고 있다¹⁰⁾. 특히 P2Y1 수용 체는 일반적으로 모든 세포에서 발현되며, 배아 발달, 재생, 세포 증식, 분화, 이동, 세포사 조절, 암 및 세포노화 등 다양 한 세포 조절에 관여한다^11-14). 활성화된 P2Y1 수용체는 P2Y1 에 결합된 G 단백질을 활성화시켜 phospholipase C-β (PLC- β)와 phosphoinositide cascade를 유도, IP3 형성과 세포 소기 관에 저장된 Ca²⁺ 방출을 유도하며, 세포내 Ca²⁺ 증가는 세포 분화 조절에 중요하게 작용한다^15-16).

최근 purinergic signaling이 human bone marrow stem cells (hMSCs)에서 세포의 이동을 포함하는 여러 생물학적 기능을 조절하는 것으로 보고되고 있으며¹⁷⁾, human hematopoietic stem cells에서 extracellular nucleotides들에 의한 P2XR 와 P2YR의 신호전달기전을 통해 clonogenic capacity가 증가함 이 알려졌다¹⁸⁾. 따라서 손상된 치아조직 수복 및 odontoblast 등 다양한 세포로 hDPCs의 분화를 조절하는 유전적, 분자적 메커니즘 규명은 선천적 또는 후천적 조직 및 세포 손상을 예 방하거나 치료에 적용할 수 있을 것이다.

본 연구자의 이전 연구에서 ADP가 P2Y1 발현을 유도하여 hDPCs의 세포이동에 관여함을 입증하였으며, 이러한 기전은 ERK1/2 pathway의 활성으로 조절됨을 확인하였다¹⁹⁾. 최근 연구에서 조직발달 및 손상된 조직 내에서 pulpal regeneration에 hDPCs의 이동, 증식, 부착이 관찰됨으로서²⁰⁾, 세포의 증식, 분화 및 다양한 세포내 기능 조절에 purinergic 신호 전달의 중요성을 고려할 때, hDPCs에서 ADP/ATP에 의 해 매개되는 purinergic receptor stimulation이 hDPCs의 분화 를 유도할 수 있는지의 가능성을 조사하였다.

ⅡMATERIALS and METHODS

Cell culture

hDPC(Human Dental pulp cell) 세포는 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units/mL penicillin, and 100 μg/mL streptomycin을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, welgen, korea)을 사용하였고, 5% CO₂, 37 ℃에서 배양하였다.

Realtime-Glo MT cell viability assay

hDPC 세포를 각 well 당 3×10³cells으로 96 well white plate (opaque-walled tissue culture plate)에 seeding한 후, 다음 날 Medium을 제거하고 ADP(10, 50, 100 μM)와 함께 MT Cell viability Substrate 1000X(Promega), ManoLuc Enzyme 1000X(Promega)를 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units/mL penicillin, and 100 ug/mL streptomycin을 함유 한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, welgen, korea)에 배합하고 각 well에 넣어주고 5% CO₂, 37 ℃에서 배양하였다. Luminometer를 이용하여 1, 24, 48, 72시간마다 luminescence를 측정하였고 1시간 때의 luminescence값을 normalize control로 사용하였다.

RT-PCR

hDPC 세포에 ADP(0, 50, 100 μM) 또는 ATP(0, 50, 100 μM)를 처리하고 24, 48시간 후 RNAiso solution(Takara, Japan)을 이용하여 제조사의 방법에 따라 total RNA를 얻었 다. total RNA는 cDNA 합성 kit(Promaga)를 이용하여 cDNA 를 합성하여 RT-PCR에 사용하였다. RT-PCR에 사용한 primer 는 Table 1과 같다.

Alizarin red

hDPC 세포에 ADP(0, 10, 50, 100 μM)를 24시간 동안 처리한 후 well plate의 medium을 제거, PBS washing, 4% paraformaldehyde 고정(15분), 증류수로 3번 세척하였다. 2% Alizarin Red(Sigma) solution (pH 4.2)을 각 well에 넣고 상온에 서 20분 동안 배양하고 다시 증류수로 5번 반복 세척해준 후 사진을 찍었다. 사진을 다 찍은 후 10% CPC (Cetylpyridinium chloride, pH 7)을 각 well에 넣어 10분간 상온에서 배양하고 OD 405 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

Western blot

ADP처리 hDPC 세포는 RIPA buffer를 이용하여 단백질을 분리하여 Bradford assay를 통하여 단백질 정량 후 SDS-PAGE 를 시행하였고, PVDF membrane에 transfer 하였다. Western blot은 5% skim milk/TBS-T에 1시간 반응, 1st anti-body (Santa cruz, P2Y1: sc-15204, β-actin: sc-47778) 4℃ overnight, 10분간 3번 TBS-T로 washing하고 2nd anti-body (goat anti-mouse IgG) 1시간 상온 반응하였다.

Statistical analysis

데이터는 EXCEL을 이용하여 평균과 표준편차를 구한 후 t-test를 이용하여 상호작용을 검증하였다. 이 연구의 통계학 적 유의수준은 p<0.05로 하였다.

ⅢRESULTS

Adenosine diphosphate (ADP)는 세포에서 다양한 생물학 적 활성을 조절하는 강력한 신호 조절 분자이나, 사람의 dental pulp cells (hDPCs)의 분화에 미치는 영향은 알려져 있지 않다. 따라서 세포 증식에 대한 세포 외 ADP의 영향을 우선 조사하기 위해, hDPCs를 24 시간 배양 후 다양한 농도 (10, 50, 100 μM)의 ADP를 24, 48시간 처리하고, 세포 증식률 을 확인하였다. 그 결과 ADP 처리 후 시간에 따라 세포의 증 식이 유의성 있게 증가하지는 않았으나 100 μM에서는 약간의 세포독성에 따라 10% 내외의 세포 증식이 억제됨을 확인하였 다. 그러나 10, 50 μM에서는 세포독성에 따른 세포증식 억제 는 관찰되지 않았다 (Fig 1).

hDPC세포는 여러 세포조절 인자와 신호조절기전을 통해 osteoblasts로의 분화가 잘 알려져 있다. 그중에서도 osteogenic differentiation progression과정에서 세포외 기질 (extracellular matrix)의 mineralization에 관여하는 중요한 인자로 alkaline phosphatase (ALP)가 잘 알려져 있으며, osteogenic differentiation progression의 초기 또는 후기 인자로 osteopontin (OPN)과 osteocalcin (OCN)등이 있다. 또한 Dentinogenesis에 관여하 는 odontoblasts에서 발현되는 DSPP와 DMP-1도 중요 분화인 자로 알려져 있다.

hDPC세포에서 ADP가 분화관련 유전자의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 50, 100μM의 ADP를 hDPC세포에 처리 한 후 24시간과 48시간에 total RNA를 추출하여 RT-PCR을 시 행한 결과 ALP 유전자의 mRNA의 발현은 24시간에는 100 μM 에서 감소를 보였고, 48시간에는 농도 의존적으로 감소되었으 며, 이와 유사하게 OCN 유전자의 mRNA도 24시간과 48시간 모두에서 100 μM ADP 처리 시 감소하는 양상을 보였다. 반 면, DSPP와 DMP1 유전자의 mRNA의 발현은 ADP의 농도 의 존적으로 증가되었고, 특히 24시간에 높은 증가양상을 보였고 48시간에는 24시간에 비해 낮은 발현을 나타냈다. 또한 ADP 가 이들 주 수용체인 purinergic receptor인 P2Y1의 발현과 연관 있는지를 확인하였다. ADP 처리에 따라 P2Y1의 발현이 DSPP와 DMP1의 발현과 일치하게 24시간에 100 μM에서 높 은 발현을 보였고, 48시간에는 점차 감소함을 보였다. P2Y1의 family 중 하나인 P2Y4의 발현 또한 P2Y1과 유사한 양상을 보였다 (Fig 2a).

Purinergic receptor의 다른 ionotropic receptor P2X family 중에서 P2X4, P2X5 그리고 P2X7의 mRNA 발현양상을 확인하 기 위해 50 μM과 100 μM의 ADP 또는 ATP를 hDPC세포에 처리하여 24시간 후 mRNA의 발현양상을 RT-PCR로 확인 결 과, positive control로 사용한 ATP 처리에서는 P2X4, P2X5 그리고 P2X7의 mRNA을 농도 의존적으로 모두 증가시켰으나 ADP는 P2X4과 P2X5의 발현에 영향을 주지 않았으며, 단지 50μM ADP 처리 시 P2X7의 mRNA가 증가함을 관찰하였다 (Fig 2b). 그들 결과로 ADP는 주 수용체인 G-protein–coupled receptor인 P2Y1 그리고/또는 P2Y4에 의해 신호전달에 관여 하고 있음을 보여주고 있다. 흥미롭게도 ADP에 의한 P2Ys과 DSPP, DMP1의 발현과 함께 세포의 형태적 변화가 관찰 되었 으며, 특히 hDPC 세포에 50, 100, 800 μM의 ADP 처리하여 세포의 형태를 관찰한 결과 Fig 2c.에서 보이는 것과 같이 100 μM 이상의 ADP 처리 시 세포의 형태학적 변화가 관찰 되었 다 (Fig 2c).

ADP 처리 시 hDPC의 분화와 P2Y1 의해 조절되는 Purinergic signaling pathway와의 관련성을 조사하였다. 먼저 P2Y1의 inhibitor인 MRS2179 (5 μM)을 처리 시 P2Y1 단백질 발현의 저해를 western bolt을 통해 확인하고 (Fig 3a), 이러한 MRS2179에 의한 P2Y1의 감소가 DSPP와 DMP1의 발현에 미 치는 영향을 알아보기 위해, 이들 유전자의 mRNA의 발현을 RT-PCR로 확인하였다. 그들 결과에서 ADP에 의해 증가하던 DSPP와 DMP1의 mRNA의 발현이 MRS2179에 의한 P2Y1 억제 시, DSPP와 DMP1의 발현이 크게 감소되는 것을 확인하였다 (Fig 3b). 이들 결과로 hDPCs에서 ADP에 의한 odontoblasts 로의 분화에서 P2Y1 pathway에 의해 조절되는 것을 알 수 있다.

ADP에 의한 hDPCs 분화를 확인하기 alizarin red S staining을 통해 mineralization에 요구되는 calcium의 생성을 확인하였다. hDPC 세포에 10, 50 그리고 100 μM의 ADP를 24시간 처리 후 alizarin red 염색법을 시행하였다. 그 결과 Alizarin red에 의한 염색이 대조군과 비교하여 10, 50 그리고 100 μM ADP 처리한 세포에서 약 50% 이상의 증가를 관찰하 였다. 하지만 ADP의 농도별 차이는 보이지 않았다 (Fig 4a).

또한, 100 μM ADP 처리에 의한 alizarin red 염색이 MRS2179를 함께 처리한 세포에서 는 calcium의 축적이 약 20% 감소하는 양상을 보였다 (Fig 4b).

ⅣDISCUSSION

Purinoceptors는 줄기세포 분화의 초기 단계에서 널리 발현 되는 수용체로 줄기세포 증식, 분화 및 이동을 포함한 줄기세 포 내 여러 신호전달기전을 조절하는 것으로 알려져 있다²¹⁾. 특히 hDPCs의 분화와 골 형성에 영향을 줄 수 있는 세포내 신호전달 인자로서의 Ca²⁺의 중요성을 고려할 때, hDPCs에서 purinoceptors 신호전달을 통해 유도되는 Ca²⁺은 줄기세포의 분화 및 재생에 중요한 인자로 작용할 수 있다22). 따라서 hDPCs가 치아모세포 (odontoblast)의 분화에 ADP에 의한 Purinoceptors의 발현 및 활성과의 연관성을 추정해 볼 수 있 다. 한 예로 이전 연구에서 Wang et. al.은 저농도의 ATP가 hDPC의 증식을 촉진 시키지만 고농도에서 (≧ 400 μM)는 hDPCs를 G1 phase에서 세포주기를 억제시켜 세포 증식을 저 해함을 보고하였다. 또한 고농도의 ATP (800 μM))에서 골 형 성 분화와 미네랄 침착을 증가시킴으로서, ATP가 hDPCs의 증식과 분화에 관여하고 있음을 보여주고 있다²³⁾. 반면, 다른 연구에서는 ATP가 세포 증식과 분화를 억제한다고 보고됨으 로서 ATP에 의한 세포분화기전에 대해서는 아직 논란의 여지 가 남아있다²⁴⁾.

본 연구에서는 hDPCs 분화와 그 분화 분자 메커니즘에 ADP의 영향에 초점을 두었다. 우선 hDPCs의 세포증식에 대 한 ADP의 영향을 조사한 결과 다양한 농도의 ADP가 hDPCs 의 세포증식에 크게 영향을 주지 않았으며, ATP와는 다르게 저농도의 ADP (10 μM 또는 50 μM)에서 세포증식을 관찰할 수 없었다. 반면 100 μM의 ADP에서 약간의 세포증식억제가 관찰됨으로서 ADP가 hDPCs의 세포 증식에 영향을 주지 않는 것으로 보인다(Fig 1).

ADP가 hDPCs의 분화에 영향을 주는지를 odontoblastic 분 화의 중요한 마커들의 발현을 RT-PCR로 확인하였다. 특히 DMP1과 DSPP는 hDPC의 odontoblastic 분화의 중요한 마커 로서, 이 연구에서, 100 μM ADP 처리 후 DMP1과 DSPP mRNA가 6시간부터 증가하였으며 24시간에 최고의 발현을 보이다가 48시간에 점차 감소하였다. 또 다른 분화 마커인 ALP와 OCN는 오히려 100 μM ADP 처리 후 control 대비 감소하는 경향을 관찰하였다(Fig 2a). 이들 결과는 DMP1과 DSPP의 발현이 hDPCs에서 ADP에 의한 분화 신호전달기전 에서 중요한 역할을 한다는 증거를 제공하고 있다. 그러나 여 러 연구에서 ADP가 골아 세포 분화 및 골 대사에 영향을 미치 지만 purinoceptors의 어떤 아형이 이러한 생물학적 과정에 관여하는지는 불분명하다. ADP의 주 수용체인 P2Ys family 중 어떤 아형이 hDPC의 치아모세포 분화에 관여 하는지를 확인하였다.

우리는 P2Y1과 P2Y4가 100 μM ADP 처리 후 DMP1과 DSPP mRNA 발현과 동일하게 6시간부터 증가하였으며 24시 간에 최고의 발현을 보이다가 48시간에 점차 감소하는 것을 확인하였다. P2Y6 및 P2Y11은 P2Y1과 P2Y4보다 상대적으로 낮은 발현을 보였으나 P2Y 아형들 (P2Y1, P2Y4, P2Y6과 P2Y11)이 모두 hDPC에서 발현되었음을 확인했다(Fig 2a). 이 는 여러 아형의 P2Ys family가 ADP에 의한 hDPC의 분화 또 는 기능에 영향을 줄 수 있음을 시사한다. 우리는 특히 높은 발현을 보이는 P2Y1의 저해제인 MRS2179를 처리하여 odontoblastic 분화 마커인 DMP1과 DSPP의 발현에 미치는 영향을 확인한 결과 ADP에 의해 증가한 DMP1과 DSPP의 발 현을 MRS2179 처리 시 억제함을 관찰하였다(Fig 3). 이들 결 과로 ADP에 의한 hDPCs의 분화는 P2Y1 신호기전을 통해 직 접적 또는 부분적으로 이들 분화 유도에 관여하고 있음을 보 여주고 있다. 이 이외에 ADP는 세포손상에 대한 여러 신호 전달 경로를 활성화하고 조직 손상 후 조직 보호 및 복구 반응 을 유도 할 수 있다. 치아 파열 손상의 초기 단계에서 ADP 방출은 통증 전달 경로를 활성화시키고 치아 펄프 전구 세포 의 증식을 촉진시킬 수 있으며, 손상의 후기 단계에서 골 형성 신호 전달 경로를 활성화시키고 mineralization를 유도할 수 있다. 따라서 이 연구에서 또한 ADP 처리에 의한 hDPCs의 분화에 따른 골 형성 신호 전달 경로 활성화를 통해 mineralization이 유도되는지를 확인하였다.

hDPCs은 ADP 처리 시 농도 의존적으로 mineralization이 유도하였으며, 흥미롭게도 낮은 농도의 ADP (10 μM)에서도 24시간 만에 mineralization이 유도됨을 관찰하였다(Fig 4a). 이는 이전 보고에서 고농도의 ATP (800 μM)가 mineralization 을 유도하는 것과는 달리 낮은 농도에서 mineralization 유도 함으로서 ADP가 ATP보다 더 민감하게 분화유도에 관여하고 있음을 보여주고 있다. 또한 hDPCs에서 ADP 처리 시 증가한 mineralization이 P2Y1 저해제인 MRS2179 처리 시 억제됨을 관찰함으로서 ADP에 의한 hDPCs의 분화가 P2Y1 신호기전을 통해 유도됨을 다시 한 번 입증하였다(Fig 4b).

여러 연구에서 ATP와 UTP가 purinoceptors를 통해 PI3K와 ERK 의 활성이 세포이동 및 조골세포와 골세포분화에 관여하 고 있음이 보고된바 있다^25-27). 본 실험실의 이전 연구에서 ADP에 의해 유도된 MAPK 중 ERK1/2가 P2Y1의 발현과 hDPCs의 migration에 관여함을 확인하였고, 특히 ERK1/2의 저해제인 U0125가 ADP에 의해 유도된 P2Y1의 발현과 hDPCs의 세포이동을 감소시켰다²⁰⁾. 이는 ADP/ATP 매개 mineralization이 세포내 ERK1/2 MAPK 신호 전달 경로와 밀 접하게 연관될 수 있는 가능성 보여주고 있다.

결론적으로, ADP가 DMP1 및 DSPP 유전자 발현을 통해 확인된 것과 같이 odontoblastic 분화 및 mineralization을 유 도하는 ADP 신호 전달 경로를 입증하였고, ADP 매개 odontoblastic 분화는 P2Y1 수용체를 통해 유도하는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 치아 손상에 의한 재생 메커니즘 에서 ADP/P2Y1 신호 전달의 역할과 hDPCs의 분화유도 분자 조절에 대한 새로운 시각을 제공하고 있다.