I.INTRODUCTION

항암화학요법을 이용한 암치료에 있어서 큰 장애가 되는 요소 중의 하나는 항암제내성이다. 암환자에 대한 항암화학요 법이 반복적, 장기적으로 사용하게 되면서 항암 부작용과 항 암내성이 발생한다. 또한 서로 다른 여러 항암제에 대한 광범 위한 교차내성을 보이는 다제내성 (multidrug resistance)으로 인해 사용 가능한 항암제의 범위가 제한됨으로서 암치료의 중 요한 문제점으로 대두되고 있다^{1, 2)}. 항암제내성은 환자 및 종 양들 사이의 유전적 차이 등을 포함한 다양한 인자들에 의해 유발될 수 있으나, 현재 보고된 세포내 항암제 내성기작의 중 요한 분자생물학적 기전을 보면, MDR 유전자에 의해 세포내 약물축적을 능동적으로 유출함으로서 세포내 약물 축적 억제 유도가 주 기전으로 알려져 있다. 다제내성은 또한 항암제의 제한적인 흡수, ceramide와 같은 막 지질들의 변화 등을 통해 세포내 약제의 축적을 제한, apoptosis 억제, DNA손상의 복구 와 약제의 비독성화를 유도 및 세포주기를 변화시킴으로 항암 제에 대한 내성을 부가적으로 유도할 수 있다³⁾.

다제내성에 의한 항암화학요법의 여러 문제점을 극복하기 위해 다제내성 기전, 내성세포의 특성 및 내성극복과 관련된 연구가 광범위하게 진행되고 있으며, 그중에서 다제내성을 유 발하는 유전자 (ATP-binding cassette(ABC) transporter; MDR-1, MRP, 그리고 BCRP)들에 대한 연구가 내성극복과 관 련되어 빠르게 진행되고 있다. 지금까지 48개의 human ABC 유전자가 확인되었고, 그중에서 multidrug resistance 1 (MDR-1 또는 ABCB1)에 의한 내성은 다제내성 기전 중에서 많은 연구가 진행되고 있다^4-7).

최근, MDR1의 과발현은 종양 세포내 paclitaxel 축적을 감 소시켜 다제내성에 관여한다는 연구결과가 있으며⁸⁾, A549 lung adenocarcinoma 세포에서 MDR1의 hypermethylation이 cisplatin에 대한 내성 억제⁹⁾ 및 간암세포주인 HepG2 세포에 서 MDR1의 antisense RNA를 이용한 MDR1의 발현 억제가 항암제내성 감소를 유도함이 보고되었다¹⁰⁾. 또한 다양한 세포 내 신호전달기전에 관여하는 microRNA (miRNA)가 약물내성 조절에 중요하게 관여하고 있는 것이 보고되고 있으며, 한 예 로, 위암세포에서 miR-129가 MDR-1을 조절하여 cisplatin 내 성 억제에 관여하며¹¹⁾, miR-186은 난소암세포에서 MDR1과 직접적으로 결합하여 이들 발현을 억제, paclitaxel과 cisplatin 에 대한 내성을 저해시켰다¹²⁾. 또한 miR-873, miR-27a, miR-145 그리고 miR-302은 각각 난소암세포, 간암세포, 장상 피세포, 유방암세포에서 직, 간접적으로 MDR-1 발현 조절을 통해 다제성 약물 내성에 관여하고 있음이 보고되고 있다 ^13-16).

그러나 최근 MDR-1을 표적으로 한 다제내성 억제 연구에서 in vitro에서 뚜렷한 효과를 보였던 verapamil과 cyclosporin-A 가 임상연구에서 실패 사례를 보고됨으로서 논란의 여지가 남 아 있다¹⁷⁾. 그러나, MDR-1의 발현이 여러 종양에서 항암치료 에 대한 반응과 예후에 관련이 있는 다수의 연구들을 통해 MDR-1을 표적으로 한 내성극복치료를 시도하고 있거나 MDR-1의 기질에 대한 저해제를 탐색하는 연구가 지속적으로 수행되고 있다.

이 연구에서 구강암 FaDu 세포에서 miRNA인 hsa-miR- 4708-3p이 MDR-1 유전자의 발현에 미치는 영향을 확인하였 다. Luciferase 분석을 통해 hsa-miR-4708-3p가 MDR-1의 3’-UTR 부위에 결합함을 확인하였고, hsa-miR-4708-3p의 발 현 유도가 MDR-1 mRNA와 단백질의 발현을 감소시키는 것을 확인하였다. 또한 hsa-miR-4708-3p의 과발현에 의한 MDR-1의 감소는 paclitaxel 내성 FaDu 세포 (FaDu-PTX)내 Rhodamine 123의 축적을 증가시킴을 확인하였다.

II.MATERIALS and METHODS

1.Cell Culture

사람 인후두 암세포인 FaDu와 paclitaxel 내성 FaDu (FaDu-PTX) 세포는 10% fetal bovine serum (FBS), 100units/mL penicillin, and 100ug/mL streptomcin을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, welgen, korea)을 사용하였고, 5% CO2, 37°C에서 배양하였다.

2.Plasmid construction

miRNA expression vector인 pSuper plasmid에 hsa-miR-47 08-3p를 cloning 하기 위해 hsa-mir-4708 primer을 합성하였 다; Forward: CATAGATCTTTTAGGAGAGAGATGCCGCCTT GCTCCTTGAACAGGAGG와 Hsa-mir-4708 primer Reverse: CATAAGCTTTTTAGTATCAGAGAGATGCCGCCTTGCTCCTC CTGTTCAAGGA (Macrogen, Korea). PCR 조건은 95°C에서 3분간 denaturation, 95°C 20초, 35~55°C 20초, 72°C 20초, 35 cycle, 72°C에서 5분간 extension을 통해 얻은 PCR 생산물을 BglII와 HindIII로 digestion 하여 pSuper basic vector에 ligation 하였다.

MDR1 3'-UTR는 pMIR luciferase report vector에 cloning 하기 위해 MDR1 3'-UTR wild type 과 mutant를 특이 primer 를 합성하여 사용하였다. MDR1 3'-UTR, Forward: CATACTAGTTGAGAGACATCATCAAGTGGAGA, Reverse: CAT AAGCTTTCACAGGCAGTTTGGACAAG를 이용하여 95°C, 5min, 9 5°C, 30sec - 56°C, 30sec - 72°C, 1min –30cycle, 72°C, 5min 조건으로 PCR 하였다. MDR1 3'-UTR mutant type은 Forward: GGACTGTAACTGACTTAAAAGATTATAGA, Reverse: TCTA TAACTTTTAAGTCAGTTACAGTCC를 통해 합성 하였고, MDR1 3'-UTR wild type과 mutant type을 pMIR luciferase vector (Ambion)에 cloning 하여 plasmid를 제작하였다.

3.Luciferase Assay

6 well plate에 2.5 x 10⁵ cells/well로 seeding한 FaDu 세포 에 pSuper basic vector 또는 pSuper/hsa-miR-4708 와 pMIR/MDR1 3'-UTR wild type 또는 mutant를 각각 co-transfection 하고 48시간 후 cell lysis buffer로 lysis하였다. 단백질은 Bradford assay (Bio-rad)를 통하여 정량하였고, luciferase assay는 promega (USA)의 luciferase assay system (E1500)을 사용하였다. Luminometer에서 측정하고 값을 단백 질 정량값으로 나누어 normalization 하였다.

4.RT-PCR analysis

각 transfection한 세포는 RNAiso solution(Takara, Japan) 을 이용하여 제조사의 방법에 따라 total RNA를 얻었다. total RNA는 cDNA 합성 kit(Promaga)를 이용하여 cDNA를 합성하 였고, PCR과 qRT-PCR에 사용하였다. 사용한 primer는 Table 1과 같다.

miRNA의 qRT-PCR을 위한 cDNA합성은 Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis and SYBRR qRT-PCR kit(Clontech)을 사용하였고 제조사의 방법에 따라 합성하여 사용하였다.

5.Western blot

단백질은 transfection 후 48시간동안 배양한 세포를 RIPA buffer를 이용하여 단백질을 분리하여 Bradford assay를 통하 여 단백질 정량 후 SDS-PAGE를 시행하였고, PVDF membrane 에 transfer 하였다. Western blot은 5% skim milk/TBST에 1시 간 반응, 1st anti-body (Santa cruz, MDR1: sc-55510, β-actin: sc-47778) 4°C overnight, 10분간 3번 TBST로 washing하고 2nd anti-body (goat anti-mouse IgG) 1시간 상온 반응하였다.

6.Rhodamine accumulation

FaDu-PTX 세포에 pSuper-4708과 pSuper basic을 Transfection하고 4시간 후 paclitaxel (PTX)을 처리하여 48시 간 동안 배양하였다. 2시간 동안 12 μM 의 rhodamine 123(Rho123)을 처리 하고 PBS로 washing 후 fluorometer에서 fluorescence를 측정하였다. 측정값은 세포수로 normalize 하 였다.

7.Statistical analysis

데이터는 EXCEL을 이용하여 평균과 표준편차를 구한 후 t-test를 이용하여 상호작용을 검증하였다. 이 연구의 통계학 적 유의수준은 *p<0.05, **p<0.01로 하였다.

III.RESULTS

이전 연구에서 HOX family 중에 하나인 HOXC6가 MDR-1 과 BCL-2의 조절을 통해 다제내성 기전에 중요한 역할을 하고 있음을 보고하였다¹⁸⁾. 따라서 HOXC6 과발현에 따른 miRNA 의 변화를 확인하기 위해 microRNA array를 시행한 결과 HOXC6가 과발현된 구강암 FaDu 세포에서 hsa-miR-4708가 3.16배 감소하였다 (Table 2). microRNA array 결과를 확인하 기 위해 miR-4708 specific primer를 사용한 qRT-PCR의 결과 HOXC6가 과발현되는 FaDu 세포에서 miR-4708이 microRNA array 결과와 유사하게 의미 있는 감소를 관찰하였다 (Fig. 1, p<0.01)).

Hsa-miR-4708에 의해 조절되는 타겟 유전자를 TargetScan, miRbase 등의 database를 통해 조사한 결과 miR-4708이 MDR1의 3’ UTR의 297-303 위치와 결합할 수 있음을 확인하였 다. miR-4708-3p와 MDR1의 3’ UTR 간에 결합을 확인하기 위 해 miR-4708을 pSuper basic vector에 유전자 재조합하였고, MDR-1의 3’-UTR 부위에 miR-4708 예상 결합 염기서열을 포함 한 wild type과 예상결합위치의 염기서열을 결실시킨 mutant type의 DNA를 삽입시킨 luciferase report vector를 제작하였 다 (Fig. 2a). pSuper-miR-4708와 MDR-1의 3’-UTR wild type luciferase vector (pMir-MDR1 wt) 또는 MDR-1의 3’-UTR mutant luciferase vector (pMir-MDR1 mut)를 FaDu 세포주에 co-transfection하여 Luciferase assay를 실행한 결과 pMir-MDR1 wild type과 pSuper-miR-4708가 co-transfection한 세포 에서 luciferase activity가 DNA 농도 의존적으로 감소하였으 며, 3 μg pSuper-miR-4708를 처리한 실험군에서 MDR-1의 3’-UTR luciferase activity가 40 % 가량 감소한 것을 확인하였 다. 반면 MDR-1의 3’-UTR mutant type에서는 같은 농도의 DNA transfection 조건에서 변화하지 않았다 (Fig. 2b).

MiR-4708이 MDR-1 mRNA와 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해 FaDu 세포에 pSuper-miR-4708과 control vector를 transfection하고 24시간 후 MDR1의 mRNA level을 RT-PCR, qRT-PCR analysis 그리고 wester blot analysis를 시행 하였다. FaDu 세포에서 miR-4708를 transfection FaDu 세포에 서 MDR-1의 mRNA level이 control 또는 vector transfection 세포에 비해 25% 감소함을 RT-PCR과 qRT-PCR을 통해 확인하 였다 (Fig. 3a). 또한 miR-4708이 MDR-1 단백질 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해 FaDu 세포에 pSuper-miR-4708를 transfection하고 48시간 후 anti-MDR1 antibody와 함께 Western blot을 수행한 결과 qRT-PCR 결과와 마찬가지로 control에 비해 33% 정도의 MDR1 단백질의 감소를 확인하였 다 (Fig. 3b).

miR-4708에 의한 MDR-1의 발현 억제가 세포내 약물 축적을 유도하는지 알아보기 위해 paclitaxel (PTX)에 대한 저항성을 갖고 있는 FaDu-PTX 세포에서 Rhodamine123의 세포내 축적 을 조사하였다. miR-4708을 과발현시킨 FaDu-PTX 세포에서 Rhodamine123의 세포내 축적이 control 세포에 비해 54% 증 가하였으며(Fig. 4a), 또한 miR-4708에 의한 MDR-1의 발현 억 제가 항암제인 paclitaxel에 대한 민감도가 증가하는지를 세포 생존율을 통해 확인하였다. 400 nM PTX만 처리한 control과 PTX와 miR vector를 함께 처리된 세포에서의 세포 생존률간 의 의미있는 유의성이 관찰되지 않았으나 miR-4708과 PTX가 함께 처리된 FaDu-PTX 세포에서 세포생존율이 유의성 있게 42% 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 4b).

IV.DISCUSSION

암 치료에 있어 항암제 내성은 항암 치료에 주요 문제점이 며, 항암제를 이용한 항암 치료 실패의 원인 되고 있다. 현재, 세포막에 존재하는 ATP-binding cassette (ABC) membrane transporter들이 항암제 내성을 조절하는 주요 기전 중 하나로 여겨지고 있으며,⁴⁾ ATP-binding cassette (ABC)-membrane transporter중 ABCG2 (BCRP)는 유방암과 두경부암에서 항암 제내성에 관여하고^{19, 20)}, 뿐만 아니라 ABCC1 (MRP-1), ABCB1 (MDR-1)등 여러 ATP-binding cassette (ABC) family들이 구 강암에서 항암제내성에 직간접적으로 관여하고 있음이 알려 져 있다²¹⁾.

MDR-1은 다재내성 관련 가장 많이 연구된 ABC transporter 중 하나로 종양억제인자인 p53과 Fos, Jun과 복합체를 형성 다양한 세포조절기능을 가지는 AP-1이 MDR-1의 발현을 조절 하는 전사인자로 보고되고 있으며²²⁾, CCAAT/enhancerbinding protein family인 C/EBPβ, NFIL6 (nuclear factor for interleukin-6) 그리고 염증과 연관된 NF-κB 또한 MDR-1 promoter에 결합 MDR1/ABCB1 발현을 조절하고 있음이 보 고되었다^{23, 24)}. 본 연구자의 이전 연구에서 homeodomain을 포함하는 전사인자인 HOXC6가 구강암에서 MDR-1의 전사를 조절하고 있음을 입증하였다¹⁸⁾. 최근 ATP-binding cassette (ABC)-membrane transporter들의 발현에 HOXC6를 포함한 다른 HOX family 유전자들이 관여하고 있음이 보고되고 있 다. 특히, human myelogenous leukemia K562/ADM 세포에 서 HOXB4의 knockdown은 P-gp, MRP1, BCRP의 발현을 억 제하고, HOXA10의 knockdown은 P-gp와 MRP1의 발현을 억 제시켜 약물내성을 감소시킨다는 보고가 있었으며^{25, 26)}, 또한 pancreatic cancer 세포에서 homeobox gene MSX2는 ABCG2 발현조절과 관련성이 확인되었다²⁷⁾. 따라서 HOX family 유전 자 또한 항암제내성 조절기전간의 매우 밀접한 연관성이 있음 을 시사하고 있다.

본 연구에서 구강암 FaDu 세포에서 항암제내성에 직,간접 적으로 관련된 HOXC6 과발현에 따른 microRNA array를 시행 한 결과 hsa-miR-4708의 발현 감소를 확인하였으며, qRT-PCR 을 통해 이들 발현이 감소함을 다시 한 번 확인하였다(Table 2, Fig. 1). Persson et. al.,은 유방암 조직에서 miR-4708을 포함 하는 여러 miRNA가 ERBB2/Her2 유전자의 발현과 함께 유도 됨으로써 임상표지인자 및 잠재적 종양 유전자 마커로 나타날 수 있음을 보여주고 있다²⁸⁾. 따라서 miR-4708이 구강암 항암제 내성에 관여하고 있는지를 조사하였다.

miRNAs database (TargetScan, miRbase)를 통해 hsa-miR- 4708-3p의 예상 target 유전자를 조사한 결과 ATP-binding cassette, sub-family B, member 1 (MDR-1/ABCB1, NM_ 000927)와 ATP-binding cassette, sub-family C, member 12 (MRP/ABCC12, NM_033226)의 3'-untranslated region (3'-UTR) 에 결합할 수 있음을 확인하였다. miR-4708와 MDR-1의 직접 적인 결합을 보기 위해 MDR-1의 3'-UTR을 luciferase vector 에 subcloning 하여 luciferase assay한 결과 luciferase activity 가 control과 비교하여 약 40 % 감소하는 것을 확인하였다 (Fig. 2). 이는 miR-4708이 MDR-1 3'-UTR에 결합하여 이들 전사를 억제함을 확인할 수 있었고, 이와 상응해서 miR-4708 과발현된 FaDu 세포에서 mRNA와 단백질의 발현이 각각 ±25%, ±33%의 감소를 확인함으로서 miR-4708이 MDR-1 3'-UTR에 결합하여 MDR-1 조절에 직접적으로 관여함을 입증 하였다(Fig. 3). 또한 paclitaxel 저항성을 가지는 FaDu-PTX 세포에서 miR-4708의 과발현은 Rhodamine123의 세포내 축 적을 증가 시킬 뿐 아니라 paclitaxel에 대한 세포 민감성을 증가시켜줌으로서 miR-4708이 MDR-1 조절은 통해 항암제내 성기전을 조절할 수 있음을 입증하였다(Fig. 4). 결론적으로 본 연구 결과는 구강암세포에서 화학요법에 의한 항암제 내성 의 획득에 miRNA-4708 조절 장애의 중요성을 나타내는 증거 를 제공하고 있으며, 또한 구강암세포 항암제내성을 저해할 수 있는 miRNA 기반 치료 전략 및 개발 대한 기반을 제공할 수 있을 것이다.