Ⅰ.서 론

우리나라에서 입술을 포함한 구강 영역에 발생한 암 환자 수는 2012년의 경우 2,913명으로 전체 암 발생 224,177건 중 1.3%를 차지한다¹⁾. 구강 및 구강 주위에 발생하는 암의 약 90~95% 정도는 구강편평세포암종(oral squamous cell carcinoma) 으로 두경부 영역, 특히 구강에 발생하는 암 중 가장 대표적인 유형이다²⁾. 구강편평세포암종은 나이가 들어갈수록 발생빈도 가 높아지므로 노년층 인구가 점점 늘어나는 현재 사회 구조 상 그 발생빈도 또한 계속적으로 높아질 것이다. 우리나라에 서는 위암, 간암, 폐암, 갑상선암 등 비교적 발생률이 높은 암 들에 비해 구강암 발생 빈도가 높은 편은 아니지만, 구강암은 수술로 암종을 제거시 악골까지 함께 절제해내어야 하는 경우 가 많아 저작과 발음 기능에 장애를 일으킬 뿐만 아니라 심미 적인 부분을 크게 손상시키기에 삶의 질을 심각하게 훼손시킨 다는 점에서 중요성이 있다³⁾. 따라서 구강암의 경우 치료 후 생존율을 높이는 것뿐만 아니라 수술 부위를 가능한 최소화할 수 있는 노력이 필요하며 치료법 개선보다는 구강암 발생을 예방하는 방안이나 발생한 구강암의 성장 속도를 늦출 수 있 는 방법을 찾아내는 것이 보다 바람직할 것이다. 한편 구강편 평세포암종의 예후를 결정짓는 것으로는 종양세포의 성장속도, 주변조직으로 침윤하거나 전이하는 능력 등의 많은 요인들이 있으며 이러한 요인들은 암세포의 악성화 전환(malignant transformation) 정도와 그에 따른 생물학적 습성(biologic behavior)의 변화를 초래한다. 따라서 구강편평세포암종 세포 의 악성화 전환과 생물학적 습성에 영향을 미칠 수 있는 인자 에 대한 이해와 파악이 치료법 개발, 재발 예방, 전이 조절과 같은 환자 예후 개선을 위해 우선적으로 필요하다.

최근 암세포가 가지는 다양한 특성들에 영향을 미치는 외 적 요인에 관한 연구가 활발해지고 있다. 이 연구들은 암세포 의 악성도 증가나 생물학적 습성 변화가 암세포내 유전자 변 화 즉, 종양유전자 활성화 또는 종양억제유전자의 불활성화와 같은 세포내 요인에만 의존하는 것이 아니라 종양주위환경 (tumor microenvironment)과의 지속적인 상호작용에 의해서 도 결정된다는 점에 주목하고 있다. 종양주위환경 요인 중에 서도 염증과 암을 주제로 한 연구가 최근 가장 활발하게 이루 어지고 있다. 1863년 Rudolf Virchow는 암과 그 주변조직의 특징이 만성염증에서 관찰되는 것과 비슷하다는 점에 착안하 여 ‘만성 염증 부위에서 암이 발생한다’라는 가설을 제시하였 다⁴⁾. 염증에 의한 자극이 세포증식을 촉진한다는 사실이 암 발생 및 진행 원인의 근거가 되기에는 약하나, 염증 시에 관찰 되는 혈관 생성 및 손상된 조직 복구에 관여하는 사이토카인 과 성장인자들이 암 발생과 진행에도 관여하는 인자들이라는 사실은 중요한 의미를 가지며, 실제로 최근 여러 역학연구와 임상연구에 따르면 암의 약 25~30%가 감염이나 염증에서 발 생한다고 보고하고 있으며, 만성염증과 암과의 다양한 관련성 이 제기되고 있다^5,6). 이와 같이 다양한 암과 만성염증의 연관 성에 대한 많은 연구가 있지만 구강암과 구강 만성염증과의 관계에 관한 연구는 많지 않다. 본 연구에서는 가장 대표적인 구강 만성염증인 치주염이 구강암세포내 유전자 발현 변화에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

Ⅱ.재료 및 방법

1.P. gingivalis 배양

P. gingivalis strain 381을 yeast extract (1 mg/ml), hemin (5 μg/ml), menadione(1 μg/ml)이 함유된 trypticate soy broth로 37℃ 혐기성 배양기에서 배양하였다.

2.세포 배양

구강편평세포암종 세포주 Ca9-22, OSC 20, SAS은 10% fetal bovine serum(GIBCO-BRL, Rockville, MD, USA)을 첨가 한 MEM/EBSS 또는 DMEM/F-12(1:1)로 37℃, 5% 이산화탄 소 배양기에서 배양하였다.

3.구강암 세포내 P. gingivalis 감염

P. gingivalis를 인산완충 식염수 용액(phosphate-buffered saline, PBS)으로 두 번 씻은 후 PBS로 희석하고 UV 흡광계 (spectrophotometer)에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도를 기 준으로 감염다중도(multiplicity of infection, MOI) 100 비율로 구강암 세포위에 분주하였다. P. gingivalis가 포함된 배지에서 3시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에 두어 P. gingivalis 가 구강암 세포 내부로 침투될 수 있도록 한 다음, 배지를 제 거하고 PBS로 씻어 내어 구강암세포내로 침투하지 못한 P. gingivalis는 제거하였다. 그 후 항생제가 들어 있는 새 배지로 교환하여 이산화탄소 배양기에서 세포를 배양하였다.

4.Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) 염색

P. gingivalis를 10 μM CFSE(Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)가 포함되어 있는 PBS 용액에서 15분간 배양 후 PBS 용액으로 두 번 씻었다. CFSE로 염색된 P. gingivalis를 위에 설명한 방법대로 구강암세포에 3시간 동안 감염시켰다. 세포내로 침투한 P. gingivalis를 공초점 현미경(confocal microscopy, Zeiss LSM 510)으로 관찰하였다. 특별히 표시하 지 않은 화학물질(chemicals)은 Sigma에서 구입하였다.

5.real-time polymerase chain reaction

P. gingivalis에 감염된 세포와 감염되지 않은 대조군 Ca9-22 세포에서 RNeasy Mini kit(Qiagen, Hilden, Germany) 를 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA 농도와 순 도를 MicroQuant microplate spectrophotometer(BioTek Instruments, Winooski, VT)를 이용하여 측정하였다. QuantiTect reverse transcription kit(Qiagen)를 사용하여 2-3 의 과정을 통해 배양된 OSCC 세포의 전체 RNA로 37 °C에서 15분간, 85 °C에서 15초간 역전사시켜 cDNA를 합성하였다. 이후 cDNA를 이용하여 TOPreal SYBR Green PCR Kit(Enzynomics, South Korea)로 ABI 7500 Real-Time PCR Detection System(Applied Biosystems)에서 real-time PCR assay를 수행하였다. PCR 반응 프로그램은 95 °C에서 10분간 반응시킨 후 95 °C에서 15초, 60 °C에서 1분간 반응시키는 조 건을 40회 반복시켰다. 각 표본의 Ct 값은 GAPDH의 Ct 값을 기준으로 비교하였다. 관찰한 mRNA는 16S rRNA로 이를 기 준으로 P. gingivalis 감염여부를 검증하였다. primer 염기서열 은 다음과 같다: bacterial 16S rRNA forward primer, 5'-TCGGTAAGTCAGCGGTGAAAC; 16S rRNA reverse primer, 3'-GCAAGCTGCCTTCGCAAT; GAPDH forward primer, 5-GAAGGTG AAGGTCGGAGTCAAC; GAPDH reverse primer, 3'-CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT.

6.mRNA 분석

1)mRNA 정제

mRNA 발현 변화를 분석하기 위하여 Trizol(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 P. gingivalis로 감염시킨 또는 감염시키지 않은 구강편평세포암종 세포에서 전체 RNA를 분리하였다. 분리된 전체 RNA는 RNeasy MiniElute Cleanup kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)을 제조사 에서 제시한 방법을 따라 사용하여 정제하였다. 분리한 mRNA에 DNase를 처리한 후 ND-100 Spectrometer(NanoDrop, Wilmington, USA)로 RNA 농도와 순도(purity)를 측정하고 사 용 전까지 –80°C에 보관하였다.

2)cDNA 합성

RNA의 질(quality)을 Agilent's 2100 Bioanalyzer System으 로 한번 더 확인 후 제조사에서 제시한 방법에 따라 cDNA 합성 과정을 시작하였다. 먼저 T7 oligo(dT) primer를 이용하 여 200 ng의 RNA으로부터 first-strand cDNA를 2시간 동안 합성하고 biotin으로 표지된 second-strand cDNA 합성 과정 을 1시간 10분 진행하였으며, 이후 16시간 동안 cDNA를 증폭 시켰다. ND-100 Spectrometer와 Agilent's 2100 Bioanalyzer System으로 정량 및 정성분석을 실시한 결과, 샘플의 흡광도 비율(260/280)은 2.1로 추후 분석에 적절한 순도를 가지고 있 음을 확인하였다.

3)혼성화 반응과 Affymetrix human ST1.0 array

표지된 cDNA를 human ST1.0 array의 bead chip에 58°C, 16시간 혼성화 반응시키고, chip을 씻은 후 array에서 나오는 신호를 이미지로 스캔하여 Expression Console software (version1.1)로 분석하였다. 스캐너 이미지 관찰로 실험결과 질 평가(quality assessment)에는 문제가 없음을 확인 후 분석 을 진행하였다(Fig. 1).

Ⅲ.결 과

1.구강편평세포암종 세포내로의 P. gingivalis 감염 확인

Ca9-22 구강편평세포암종 세포에 P. gingivalis를 분주하고 3시간 경과 후 균이 없는 깨끗한 배지로 교환하고 24시간 후 에 공초점 현미경으로 관찰한 결과, CFSE 에 염색되어 형광을 보이는 P. gingivalis균이 세포내에서 관찰되었다(Fig. 2). P. gingivalis 감염 6시간, 24시간, 48시간 후 Ca9-22 세포내에서 의 세균 16S rRNA 존재 유무를 real-time qPCR로 확인한 결 과, 대조군은 cDNA가 들어있지 않은 음성대조군과 비슷한 Ct 값을 보였으며 P. gingivalis 감염군에서는 시간이 경과할수록 양이 줄어들었으나 대조군에 비해 상대적으로 매우 높은 16S rRNA 비율을 보여 P. gingivais의 세포내 감염을 추가 확인하 였다(Fig. 3).

2.P. gingivalis가 일으키는 구강편평세포암종 세포내 mRNA 변화

이전의 연구에서는 치주염이 대개 만성 염증성 질환이므로 임상적 상황과 유사하게 구강편평세포암종 세포를 P. gingivalis 균에 오랫동안 노출시켜 구강편평세포암종 세포내 단백질 변화를 관찰하였으나, mRNA의 경우 P. gingivalis균에 의해 그 변화가 즉각적이면서 일시적으로 나타나게 되므로 본 실험에서는 단시간 감염 후 일어난 변화를 관찰하였다. 다양 한 종류의 구강편평세포암종 세포에서 공통적으로 일어나는 변화를 관찰하기 위하여 Ca9-22, OSC20, SAS 세 가지의 세포 주를 사용하였으며, 각각의 구강암 세포와 P. gingivalis 균을 3시간동안 함께 배양 후, 균을 수세하고 48시간 후 세포를 모 아 mRNA를 추출하고 감염에 따른 그 발현 변화양상을 분석 하였다. 구강편평세포암종 세포내 mRNA 발현 정도를 점으로 표시하여 균에 감염되지 않은 대조군과 균에 감염된 구강암 세포를 비교하였다(Fig. 4). Ca9-22, OSC20, SAS 세 종류의 구강편평세포암종 세포내에서 공통적으로 증가 또는 감소하 는 mRNA를 분석하여 본 결과를 대조군에 비해 P. gingivalis 감염군에서 1.5배 이상 차이가 나는 유전자들만 벤다이어그램 으로 표시한 결과는 Fig. 5와 같다. P. gingivalis 세균 감염은 각각의 구강편평세포암종 세포에서 다양한 기능들과 관계된 유전자에 영향을 미쳤다(Fig. 6). 세 종류의 구강편평세포암종 세포들에서 공통적으로 증감 변화를 보이는 특징적인 유전자 들은 Table 1 및 Table 2와 같다.

Ⅳ.고 찰

P. gingivalis는 만성 염증인 치주염의 발생과 진행에서 일정 역할을 수행하는 주요 미생물 병원체로, 그람 음성 혐기성균 이며, 숙주세포로의 침입을 위한 통로로 막지질 부분 (membrane lipid raft)을 활용함으로써 여러 유형의 세포로 침 입이 가능하다^7-9). 또한 숙주세포 내의 P. gingivalis는 일정 시 간 동안 생존이 가능한 특징을 갖고 있어서, P. gingivalis의 암 세포로의 침입은 세포의 신진대사에 영향을 미치거나 세포 내 다양한 신호전달 체계에서의 변화를 일으킬 수 있을 것이 다^10,11). 성인에서 비교적 흔한 만성염증 질환인 치주염을 가지고 있는 구강암 환자의 경우, 구강암 주위미세환경 (microenvironment)에 존재하는 치주세균이 구강암 세포내로 침투하여 구강암의 악성도를 높이거나 구강암의 생물학적 습 성을 변화시킬 수 있을 것으로 추정된다^12-14).

P. gingivalis에 의해 유의미한 발현량 변화가 관찰된 mRNA 중, SERPINEB3와 4는 18q21.3 위치에서 만들어지는 유전자 로 사람 편평세포암종항원(squamous cell carcinoma antigen, SCCA)으로도 알려져 있는 serine proteinase inhibitor이다. SERPINEB3는 중성형의 SCCA로 SCCA1이라고 표시하며, 정 상 세포와 일부 악성종양세포의 세포질에서 관찰된다고 알려 져 있다. 반면 산성형 SCCA(SCCA2)인 SERPINEB4는 악성종 양 세포에서 주로 발현되며 암 환자 혈청에서 관찰된다. 또한 임상 병기가 높아질수록 SCCA 혈청내 수치가 높은 것으로 보 고되었다. 이러한 결과들은 SCCA가 암세포의 악성도 (aggressiveness) 증가에 기여하는 요인임을 의미한다¹⁵⁾. 이처 럼 SCCA가 편평세포암종 유무를 반영하는 중요한 표지자로 보고되고 있지만, 대부분의 SCCA 관련 연구는 자궁경부, 비인 두 등과 같은 구강이 아닌 다른 조직에서 관찰되는 편평세포 암종이 대상이었다. 많지 않은 구강편평세포암종 대상 연구 중, Feng 등은 건강한 사람에 비해 구강편평세포암종 환자 혈 청에서 SCCA가 더 높은 수치로 관찰되며, 혈청 SCCA 레벨과 치료 반응도 사이에 상관관계가 있음을 보고하였다¹⁶⁾. 본 연 구에서 P. gingivalis는 세 종류의 구강편평세포암종 모두에서 SCCA 유전자 발현을 증가시켰으며, 구강암 주위미세환경에 존재할 수 있는 P. gingivalis가 SCCA 유전자 발현을 증가시킴 으로서 구강암의 악성화 과정에 기여할 것으로 추정된다. P. gingivalis와 연계된 SCCA 연구는 거의 없으나, Kretschmar 등 이 최근 건강한 사람과 치주염 환자의 치은 열구액(gingival crevicular fluid)내 SCCA 농도를 ELISA로 비교한 결과, 치주 염 환자군 내에서 P. gingivalis 균이 검출되는 경우에서도 SCCA가 더 증가하지 않았다고 보고하였다¹⁷⁾. P. gingivalis에 의해 SCCA 유전자 발현이 증가된 것으로 확인된 본 연구 결과 와 달리 치은 열구액에서 SCCA 단백질 증가가 나타나지 않는 것에 대하여, 유전자 레벨에서의 증가가 단백질 합성으로까지 연결되지 않는 것으로 해석할 수도 있으나, 두 연구에서 세포 내로 침윤하여 세포내에서 일으키는 변화와 주위 조직으로 유 리해내는 변화를 관찰한 차이에 기인한 것으로도 추정할 수 있다. 본 연구 결과를 바탕으로, 향후 구강편평세포암종 환자 의 종양조직에서 SCCA 단백질 발현 정도와 환자의 치주염 이 환 정도 비교, 종양 병기와 SCCA 발현 정도 비교 연구 및 P. gingivalis 존재 유무와 SCCA 발현 정도, 종양 병기 및 예후와 의 상관관계를 확인하는 연구들을 통해, 치주염과 P. gingivalis가 구강암 세포 악성도에 미치는 영향과 병인 과정에 서 SCCA 역할, 진단 및 치료 과정에서 SCCA 지표 활용 방안 등에 대한 이해를 높일 수 있을 것으로 기대한다.

P. gingivalis에 의해 발현 증가가 관찰된 mRNA 중, ID1과 ID3 유전자는 각각 inhibitor of DNA binding 1과 3으로 전사 인자에 결합하여 이를 방해하는 negative helix-loop-helix 단 백질이다. Inhibitor of differentiaion이라고 명하기도 하며 세 포 성장과 분화 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Sharma 등이 전립선암에서 다양한 ID 유전자들의 역할 을 조사한 결과 ID1과 ID3 발현이 높아질수록 전립선암의 조 직학적 등급이 높아짐을 보고하였고, 또한 ID1과 ID3에 의한 p21과 p27 발현 저하가 전립선암 악성도 증가에 기여한다고 주장하였다¹⁸⁾. 최근 한 연구에 의하면 소세포폐암종에서 ID1 과 ID3 유전자를 억제한 결과 종양세포 증식속도 뿐만 아니라 침윤능과 부착비존성 성장(anchorage-independent growth) 가 감소되었으며 동물 실험에서 두 유전자를 동시에 억제한 경우 종괴 크기가 현저히 작아졌다고 하였다. 이러한 종괴 크 기 감소는 혈관형성 감소와 세포자멸사 증가를 통한 것으로 관찰되었다¹⁹⁾. 또 다른 연구는 ID1과 ID3 공동 발현 (coexpression)이 비소세포폐암종 환자의 항암제 치료 결과와 연관성이 있음을 보고하면서 치료저항성과의 상관성을 제시 하고 있다²⁰⁾. 여러 연구들에서 알 수 있듯 ID1과 ID3은 암 진행, 침윤 및 치료 반응성에서 중요한 역할을 하는 단백질이 므로 P. gingivalis가 구강암세포에서 ID1과 ID3 발현을 높인 다는 점은 시사하는 바가 크다. 추후 P. gingivalis에 의해 단백 질 수준에서 ID1과 ID3 발현이 증가함을 확인하고 침윤능과 전이능에 미치는 영향 및 기전 분석을 통해 구강암 진행과정 에서 P. gingivalis 침윤 또는 치주염이 가지는 중요성에 대해 파악할 수 있을 것이다.