I.INTRODUCTION

구강암은 한국인에서 암 전체의 발생빈도에서 약 1.29%를 차지하고[1], 남성에서는 다섯번째, 여성에서는 일곱번째로 많이 발생하는 암이다. 또한 미국 국립암연구소 통계에서는 전체의 암중에서 구강암이 5.09%를 차지하고, 약 50%의 낮 은 5년 생존율을 보인다고 보고되고 있다[2]. 구강점막을 덮 고 있는 상피세포가 암세포로 변화되면서 발생하는 편평상피 세포암종이 구강암의 가장 많은 비율을 차지하고, 혀나 침샘 등에 발병되며, 림프관을 통해 전이가 된다[3]. 육안으로 조기 발견이 가능하며, 외과적 수술이나 방사선 요법, 화학 요법을 이용한 치료법이 있음에도 불구하고 구강암의 예후가 크게 향상되지 않는 것은 암종의 성장과 침습 등에 대한 이해가 부족하기 때문이라고 할 수 있다. 따라서 구강암세포에 대한 연구로 구강암 발생을 예방하며, 치료에 도움을 줄 수 있다.

세포에는 세포 주기를 조절함으로써 성장을 억제하는 신 호경로 (예를 들어 p53 pathway, APC gene, NF2 gene 등이 관여하는 신호경로)가 존재하는데, 그 중 Hippo signaling은 1995년 초파리에서 처음 밝혀지면서 지금까지 연구가 진행 되고 있다[4].

Hippo signaling은 Salvador-Warts-Hippo pathway라고도 알려져 있으며, 정상적인 세포의 성장과 증식, 그리고 종양의 성장 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다[5]. 세포막 부터 핵까지 연결되어 있는 신호경로로 최소 35개 이상의 단백질 네트워크를 이루고 있으며, 초파리의 유전자 screening 을 통해서 밝혀진 관련 단백질로는 serine/threonine kinase 인 Hippo(Hpo)와 Warts(Wts)가 있고, 이 단백질들과 결합하여 활성을 하는 Salvador(Sav), Mob as tumor suppressor(Mats), 그리고 전사인자와 결합하는 Yorkie(Yki), Scalloped(Sd)등 이 있다[6]. 그 중, Hpo는 adaptor protein인 Sav와 결합하여 활성화, 즉 자가인산화가 되고, Wts를 인산화하여 활성화 시 킨다. 활성화된 Wts는 하위분자인 transcription co-factor Yki를 인산화 시킨다. 인산화된 Yki는 세포질에 머물면서 proteasome인 14-3-3과 결합하여 분해가 된다. Hippo signaling에 의해 인산화되지 않았을 경우, Yki는 핵 내로 들 어가 Sd와 결합하여 Sd의 전사를 활성화 시킨다[7]. 초기의 연구들은 Yki의 과발현 또는 Hpo, Wts발현의 억제를 통하여 초파리의 눈이나 날개의 비정상적인 발현을 확인하였다. 이 는 초파리의 증식과 세포사멸에 Hippo signaling이 역할을 한다는 것을 알 수 있다[8].

이렇게 Hippo signaling에 관여하는 단백질들은 인간에서 유사한 상동체를 가지는데, Hpo의 상동체는 mammalian STE20-like protein kinase1(MST1), Wts는 Large tumor suppressor1/2(LATS1/2), Sav, Mats는 kinase들과 결합하는 Salvador homologue1(SAV1), MOV kinase activator1A/B (MOB1A/B), 그리고 transcriptional co-activator인 Yki는 Yes-associated protein(YAP), Sd는 Transcription factor (TEAD 2/3/4)이다[9]. Hippo signaling이 활성화 되면, MST kinases는 SAV1과 복합체를 이루어 LATS kinase를 인산화 시키고, LATS kinases와 MOB1 cofactor는 그 하위 표적인 YAP을 인산화시킨다. 인산화된 YAP은 14-3-3 protein과 결 합하여 세포질에서 분해된다. YAP가 분해됨에 따라 핵 내에 서 TEAD family와의 결합이 저해된다. 즉 Hippo signaling이 활성화되면 YAP가 억제되고, YAP와 결합하는 유전자 발현 이 억제되어 세포와 조직의 성장이 제한된다. 반면 Hippo signaling의 비활성은 YAP가 핵 내로 들어가 전사인자인 TEAD와 복합체를 이루고, 유전자 발현을 일으켜 connective tissue growth factor(CTGF), cystein-rich 61(Cry61), fibroblast growth factor(FGF)와 같은 성장인자의 분비를 통해 세포의 성장을 촉진하고 세포사멸을 억제하게 된다[10].

또한 종양에서의 Hippo signaling은 세포나 장기 크기의 성장을 조절한다고 알려져 있으나, 하위 신호 factor 중 YAP 는 세포 성장을 촉진하는 Oncoprotein으로 알려져 있다.

이번 연구의 주제인 Yes-associated protein(YAP)은 1995년 처음 발견되었으며, 인간의 염색체 11q22에 존재하고 초파리 의 Yki와 상동체를 이루는 인자이다[11]. Hippo signaling을 조절하는 신호전달 분자 중 하나이며, 65kDa의 크기로 핵과 세포질에 고루 분포되어 역할을 한다[12]. 핵 내에서 전사인 자와 결합하여 다른 유전자들의 전사에 관여를 하지만, DNA 자체에 결합하지는 않으며 보조 활성체로써 작용한다. Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif(TAZ) 는 YAP와 paralog이며, 따라서 Hippo signaling에서 YAP와 유사한 역할을 하는 factor로 보고되어 있다[13]. YAP는 Hippo signaling의 ser/thr kinases MST2와 LATS kinases의 영향을 받는다. YAP는 인산화 된 LATS에 의해 인산화됨으로 써 세포질에 존재하며, 전사인자와 결합 할 수 없어서 성장이 억제된다[14]. 하지만 YAP가 인산화되지 않으면 핵 내로 들 어가 TEAD1/2/3/4, RUNX1/2, AKT, SMAD7, p73 등과 같은 다양한 전사인자들과 결합하여 작용한다. 전사인자인 TEAD 는 YAP와 결합을 통해 조절된다고 알려져 있고[15], CTGF, Cyr61, FGF1등의 성장인자들을 발현하면서 세포증식에 관여 를 한다. 즉, Hippo signaling의 활성은 세포주기의 정지와 세포사멸을 통제함으로써 세포와 조직의 성장을 조절하고, 반대로 Hippo signaling의 비활성은 성장인자의 분비로 인한 세포와 장기의 성장을 촉진하고, 분화, 상처 재생을 조절한 다. Xin M et al.의 논문에 의하면 YAP에 의해 insulin like growth factor 조절은 심장세포 증식과 mouse 배아 심장크기 에 연관이 있는데, YAP가 결핍된 mouse 배아에서는 심장증 식이 지연되었고, 그로 인해 mouse embryonic stage 10.5에 서 사망한다고 밝혔다[16]. 그리고 mouse 배아의 피부발달 동안 YAP의 발현은 핵에서 높게 나타났고[17], 간에서 YAP를 과발현시킨 Mice 모델에서 간세포의 증식을 야기함으로써 정상적인 간의 크기보다 약 4배가 증가했다[18,19]. 즉, 정상 적인 세포에서는 YAP가 세포의 성장과 증식에 중요한 역할 을 한다는 것을 확인할 수 있다.

또한 YAP는 여러 종류의 종양의 발달과 진행에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 많은 연구에 의하면 다양한 종류 의 cancer에서 YAP가 과발현 하는 것을 밝혔고, 현재도 계속 연구가 진행 중이다[20]. 유방암 중 침윤성 소엽암(invasive lobular carcinoma)에서 핵과 세포질에 YAP 발현이 정상조 직보다 많이 발현하는 것을 western blot과 면역화학염색을 통해서 확인했다[21]. 위암에서는 YAP의 과발현과 함께, 림 프절로 전이에 연관이 있다고 밝혔다[22]. 인간 뇌의 종양과 악성 뇌종양인 Glioblastoma에서도 핵 속의 YAP 발현이 넓 게 나타났다[23]. 반대로 YAP의 발현을 저해시켰을 경우에는 췌장암에서 세포증식과 클론형성이 감소하였다[24]. 하지만 구강암에서는 많은 연구가 되어 있지 않은 실정이다.

본 연구에서는 구강편평세포암종의 세포주에서 YAP의 발 현을 mRNA와 Protein 수준에서 확인하고자 한다. 13 종류의 구강편평세포암종 세포주에서 YAP의 발현양상을 확인하여 많이 발현하는 세포주를 선택하고, 추후 연구에서 sh.RNA를 이용하여 YAP의 발현을 저해시킨 후 세포의 증식, 전이, 세포 사멸에 어떤 변화가 있는지 확인하고자 한다. 그 연구결과로 구강편평상피암종과 YAP 상관관계를 이해함으로써 구강암 치료의 새로운 치료제로서의 가능성을 제시할 수 있을 것이 라 기대한다.

II.MATERIALS AND METHODS

1.Cell culture

SCC4, SCC9, SCC15, SCC25는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구매하였고, HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, HO-1-N-1, HO-1-U-1는 JCRB Cell Bank (Japanese Collection of Research Bioresources, Japan)에서 구매하였다. KOSCC11, KOSCC25B, KOSCC33A 는 서울대학교 치의학대학원의 교수님께서 설립한 세포주를 받아서 사용하였다.

SCC cell line은 Ham’s F12/Dubecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Cellgro, VA, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, CA, USA), 1% antibiotic antimycotic solution (100 U/ml penicillin and 100 g/ml streptomycin, JBI, Korea) 이 포함된 배양액을 사용했다. HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, HO-1-N-1, HO-1-U-1는 RPMI1640 (Cellgro), 10% FBS, 1% antibiotic antimycotic solution 이 포함된 배양 액, KOSCC cell line은 DMEM, 10% FBS, 1% antibiotic, 0.1% hydrocortisone (Sigma, St louis, MO, USA)이 포함된 배양액 을 사용했다. 세포의 배양은 2-3일에 한번씩 계대배양을 진행 하였으며, 37℃, 5% CO₂ incubator (SANYO, Japan )에서 배양하였다.

2.PCR & Realtime-PCR

YAP의 mRNA 발현은 PCR과 Realtime-PCR을 통해서 확인 하였다.

세포배양을 통해 얻어진 세포 pellet은 Trizol reagent (ambion, CA, USA)를 이용하여 total RNA을 추출하였다. cDNA합성은 2 μg RNA를 amfiRivert cDNA synthesis platinum Master Mix (GenDEPOT, TX, USA)를 이용하여 진행하였다. 합성된 cDNA 2μg을 이용하여 PCR을 진행하였고, Realtime PCR에서는 cDNA를 100 ng으로 희석하여 사용하였다.

Real time PCR은 QuantiNovatm SYBR Green PCR kit (Qiagen, Germany)를 사용하여, 7500-Real time PCR (Applied Biosystems, CA, USA) 기기를 이용하여 수행하였다.

실험에 사용한 Primer는 다음과 같다. YAP Forward, 5’- GTG AGG CCA CAG GAG TTA GC -3’ ; YAP Reverse, 5’- GGT GCC ACT GTT AAG GAA AGG -3’ ; GAPDH Forward, 5’ – CTT TGT CAA GCT CAT TTC CTG G -3’ ; GAPDH Reverse, 5’ – TCT TCC TCT TGT GCT CTT GC -3’

3.Western blotting

세포 pellet을 RIPA lysis buffer (Cell signaling, MA, USA) 와 100X Protease mixture (GenDEPOT)를 사용하여 protein 을 추출하였고, 단백질농도는 BCA assay (PerBio, UK)를 사 용하여 측정하였다.

30 μg protein을 12% gel을 이용하여 전기영동 하였다. PVDF membrane에 이동시켜 3% skin milk로 blocking하였 다. 1차 항체로 αg-tubuline (Santa Cruz, TX, USA), YAP (Abcam, MA, USA)을 이용하였다. 그 후 2차 항체로 반응시 킨 후, West-Q Chemiluminescent Substrate Kit (GenDEPOT) 를 사용하여 Ez-Capture MG 장비 (ATTO, Japan)로 단백질 발현을 확인하였다.

4.자료처리 및 통계방법

Western blotting의 분석은 CS Analyzer (ATTO)를 이용하 여 시행하였다.

III.RESULTS

A.Oral squamous cell carcinoma cell line에서 YAP mRNA 발현 양상 확인

13종류의 구강편평상피세포암종 세포주에서 YAP의 mRNA 의 발현을 확인하기 위해, PCR과 Real-time PCR 기법을 이용 하였다. PCR결과는 13개 cell line에서 YAP가 모두 발현되었 고, 발현량의 뚜렷한 차이는 보이지 않았다(Figure 1). Real-time PCR의 결과도 마찬가지로 13개 구강편평상피암종 에서 YAP의 mRNA의 발현의 큰 차이를 발견하지 못하였다 (Table 1).

B.Oral squamous cell carcinoma cell line에서 YAP protein 발현 양상 확인

Western blot을 통해 YAP 단백질 발현 양상을 확인하였 다. 모든 세포주에서 발현을 확인할 수 있었으며, 특히 HSC2 과 KOSCC11 세포주에서 눈에 띄게 많이 발현하는 것을 확인 할 수 있었다(Figure 2). 발현양의 intensity를 프로그램을 이 용하여 확인한 결과 높은 값을 확인할 수 있었다(Table 2).

IV.DISCUSSION

Hippo signaling은 초파리와 포유류에서 잘 알려진 대표적 인 Tumor suppress signaling 중 하나이다. 이미 많은 연구들 은 Hippo signaling이 세포와 조직의 성장, 세포사멸 조절을 하는 중요한 체내 신호전달 기전이라는 것을 밝혔다[25]. 신 호전달 내에는 Tumor suppressor 역할을 하는 MTS, LATS kinses와 oncoprotein역할을 하는 YAP, TAZ등 많은 protein 들이 존재하며 신호전달에 영향을 준다[8,12,13,14]. Hippo signaling의 초기 연구들은 한 세대가 짧은초파리를 이용하였 고, 그 결과로 신호에 관여하는 유전자들의 돌연변이가 초파 리의 눈과 날개 등에서 비정상적으로 성장하는 것을 발견하 였다[8]. 이후의 연구들은 Oncoprotein으로 알려져 있는 YAP 발현을 통해, mouse 배아의 성장이나 재생이 필요한 간, 피 부에서 YAP가 많이 발현하는 것을 확인하였다[16,17]. 또한 간, 소장, 위, 뇌, 갑상선 종양에서 많은 YAP 발현을 확인하였 다[20-23].

이번 연구에서는 구강편평상피세포암종 세포주에서 Hippo signal pathway에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 YAP 의 mRNA와 protein의 발현양상을 확인하였다. 그 결과 13종 류의 구강평편상피세포암종 세포주에서 YAP가 모두 발현하 였으며, 특히 HSC2, KOSCC11 2종류의 세포주에서 YAP protein 발현이 가장 높게 나타났다. Ge L.등은 head and neck squamous cell carcinoma(HNSCC) 환자의 조직에서 YAP의 발현이 benign 환자의 조직과 면역조직확학염색법으 로 비교했을 때 더 많이 발현됨을 확인하였다. 또한 구강편평 세포암종 세포주에서 siRNA를 이용하여 일시적으로 YAP의 발현을 저해시킴으로써 p63과 같은 hippo signaling에 관여 하는 단백질의 별다른 차이가 없음을 확인하였다[26]. 하지 만, 구강편평세포암종 세포주에서 shRNA를 이용하여 안정적 으로 YAP의 발현을 억제시킨 연구는 전무한 실정이다.

따라서 본 연구는 구강편평상피세포암종에서 Hippo signaling 신호경로를 조사하는 초기 연구로 YAP의 발현을 본 결과이다. 이 결과를 바탕으로 추후 연구에서 YAP가 과발현 한 세포를 선택하고 sh.RNA를 이용하여 YAP의 발현 을 저해시킨 후, 세포의 증식과 성장, 세포 사멸과의 관계를 확인하며, YAP의 단백질의 오랜 시간 저해로 인한 형태학적 인 변화를 관찰하고, 더불어 YAP의 영향을 받는 hippo signaling에 관련된 다른 단백질들의 발현 양상을 확인하려 고 한다.

이 연구결과들을 이용하여 구강암에서의 Hippo signaling 신호경로를 조절하여 치료에 기여할 것이라 기대한다.