I.INTRODUCTION

최근 각광을 받고 있는 조직공학적 재생술은 지지체에 줄기 세포 또는 특정 조직을 형성할 수 있는 분화된 세포, 또는 특정 유전자 및 생활성 물질을 부착시켜 재생이 필요한 부위에 이식 함으로써 보다 효과적인 재생을 도모하고자 하는 술식이다^1-3).

효과적인 조직공학적 재생을 이루기 위해서는 원하는 부위 에서 원하는 조직을 형성할 수 있는 세포의 효과적인 도입이 관건이 된다. 이는 지지체에 분화된 세포를 직접 부착시켜 이식하거나 또는 재생이 요구되는 부위에 존재하는 미분화 세포를 원하는 세포로 분화를 유도할 수 있는 유전자나 생활 성 물질을 효과적으로 도입시킴으로써 이룰 수 있다^4-5). 따라 서 재생효과의 극대화를 위해서는 이런 세포 또는 인자 들을 효과적으로 도입하기 위한 지지체의 개발과 세포 배양법의 확립이 선행되어야 한다.

특별히 골조직의 재생을 위해서는 골의 특성상 하중을 지 지해야 할 필요가 있을 수 있으므로 골과 유사한 물리·화학 적 특성을 살린 지지체의 개발이 이어어져 왔다^6-8). 다수의 골재생용 지지체는 바이오세라믹과 같은 무기물을 기반으로 주로 다공성 구조의 블록 형태로 제작되고 있다⁹⁾. 그러나 치 조골에서와 같이 소량의 골증대가 요구되는 경우에는 과립 또는 분말 형태의 골이식체가 널리 활용된다.

치과용 보철물의 지지를 위한 치조골의 증대가 필요한 경 우 골이식술과 더불어 골유도재생술이 대표적인 술식이 되어 왔다. 따라서 세포가 부착된 막성 지지체를 차폐막 형태로 단독 또는 다양한 과립형 골이식제 이식과 병용함으로써 효과 적인 조직공학적 골재생을 도모 할 수 있을 것으로 기대된다.

본 연구에서는 생체적합성이 양호한 생분해성 PHBV(3- hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)를 기본재료로 하여 교원질을 1:1 비율로 혼합하여 전기방사를 통해 직경 500nm 크기의 나노섬유들이 격자모양으로 짜여진 나노섬유막을 제 작하였다. 그리고 여기에 백서 두개골막 유래 세포들을 부착 식켜 백서 경골 골결손부에 적용시켜 조직공학적 골유도재생 술의 효용성을 평가하였다.

II.MATERIALS AND METHODS

1.실험재료

조직공학적 골재생용 기법을 적용하여 골유도재생술의 효 과를 증대시키기 위한 세포 지지용 차폐막으로 PHBV와 교 원질을 1:1로 섞어 전기방사하여 직경 500nm 크기의 나노섬 유들이 무작위로 격자모양으로 짜여진 PHBV-교원질 나노섬 유막을 평가대상으로 하였다.

실험동물은 200g 전후의 Sprague-Dawley계 웅성 백서를 활용하였다.

2.실험 방법

가골결손부 형성

백서 경골에 인위적으로 형성한 골 결손부의 회복 양상을 평가하기 위해 먼저 실험동물을 마취한 다음, 양쪽 경골 상방 의 털을 면도칼로 제거하고, 알콜 용액으로 소독하였다. 그리 고 15번 수술용 칼로 상방 피부를 1cm 크기로 절개하여 경골을 노출 시킨 후, 저속 치과용 엔진을 이용하여 발열이 되지 않도록 생리식염수를 수주하면서 5×2mm 크기의 골 결손부를 형성하였다.

나PHBV-교원질 나노섬유막 및 PHBV 나노섬유막-세포 복합체 이식

48well plate를 이용하여 백서 두개골막 유래의 일차배양 세포를 PHBV-교원질 나노섬유막에 파종하여 일주간 골유도 배양조건하에서 배양한 다음, 좌측에는 세포를 부착시키지 않은 PHBV-교원질 나노섬유막을 우측에는 세포를 배양 부착 시킨 PHBV-교원질 나노섬유막을 경골의 골결손부에 각각 이 식하였다. 그리고 5-0 vicryl^® 봉합사를 이용하여 층별 봉합한 후, 타도마이오셀^® 연고를 도포하였다. 감염 예방을 위해 추 가적으로 폭소린^® (0.1cc/day)을 3일간 근주하였다. 섬유막 을 이식하지 않은 군을 대조군으로 하여 동일한 방법으로 처 리하였다.

다조직학적 관찰

실험 3주째 실험동물을 희생시켜 양쪽 경골을 절취하여 10% 중성 포르말린으로 고정하였다. 통법에 준하여 10% Formic acid 용액으로 탈회시켜, 파라핀 포매 블록을 제작한 다음, 5um 두께의 절편을 형성하였다. 이들 절편을 H&E 염색 한 후 조직학적 골성 회복 양상을 광학현미경으로 관찰하였다.

III.RESULTS

골결손부 처치 3주째, 차폐막을 위치시키지 않은 군에 비 해 PHBV-교원질 나노섬유막만을 위치시킨 군에서 보다 양 호한 골성회복을 이루었다. 그리고 두개골막 유래 일차배양 세포를 PHBV-교원질 나노섬유막에 부착시켜 골유도배양조 건하에서 일주간 배양하여 위치시킨 실험군에서 보다 양호 한 골성 회복을 나타내었다. 차폐막을 이식하지 않은 군에서 는 회복된 피질골판이 골수양 결체조직이 다수 함유된 불연 속적인 판상구조를 보였고, 일부 골조직들은 골세포를 다수 함유한 미성숙 섬유골 양상을 나타내었다(Figure 1A). 세포 를 부착시키지 않는 PHBV-교원질 나노섬유막을 이식한 군 은 비교적 양호한 판상 구조의 성숙된 치밀골에 의한 회복을 나타내었으나 골수양 결체조직이 내부에 함유되어 완전한 골판 구조를 이루지는 못하였다(Figure 1B). 반면, PHBV-교 원질 나노섬유막에 백서 두개골막 유래 세포를 부착 배양하 여 이식한 군에서는 조혈성 골수 영역이 뚜렷이 감소된 보 다 치밀한 층판골에 의한 양호한 골성회복양상을 나타내었 다(Figure 1C).

IV.DISCUSSION

일반적으로 골조직은 재생능력이 양호한 조직으로 분류되 며, 임계크기 이하의 골손상에서는 골모세포들에 의해 반흔 형성 없이 완전한 골성회복을 이룰 수 있다. 그러나 여러 원인 에 의해 과도한 골결손이 이루어 질 경우는 골이식술과 같은 부가적인 술식이 요구된다. 이런 경우 자가골 이식을 비롯한 다양하게 처리된 동종골 및 이종골 그리고 생합성 골이식체들 에 의한 골성 회복이 다양한 방법으로 시도되고 있다^10-12).

최근 지지체에 세포 또는 유전자 및 생활성 물질 등을 부착 시켜 조직 손상부위에 이식하여 효과적인 재생을 도모하는 조직공학적 재생술이 확립되면서 이들의 재생 효과를 극대화 하기 위한 다양한 노력이 경주되고 있다¹³⁾. 치조골의 경우 다 른 부위의 골조직과 달리 골결손부위가 작은 경우 과립 또는 분말형의 골이식제를 사용하게 되므로 이식된 골이식제를 효 과적으로 그 위치에 유지시키는 것이 용이하지 않다. 따라서 골유도재생술에 활용되는 다양한 흡수 또는 비 흡수성 차폐막 을 이용하여 골이식체를 제위치시켜 섬유조직의 유입을 차단 하게 된다. 최근에는 이런 차폐막 대용으로 자가혈에서 얻어 지는 혈소판 농축 섬유소막(PRF)을 이용함으로써 골재생효과 의 극대화를 도모하기도 한다¹⁴⁾.

치조골의 효과적인 증대를 위한 또다른 시도로 차폐막에 골형성을 도모할 수 있는 골모세포 또는 골손상부위의 미분화 세포들을 골모세포로 유도할 수 있는 다양한 생활성물질을 부착시키는 골유도재생술 단독 또는 이들 술식의 골이식과 병용을 들 수 있다.

이에 본 실험에서는 세포의 부착 보관이 용이한 PHBV-교 원질 나노섬유막을 조직공학적 골재생술을 겸비한 골유도 재 생술의 차폐막으로써의 효용성을 평가하였다.

PHBV는 양호한 생체적합성과 흡수성을 지닌 물질로 다양 한 물질과 혼합하여 전기방사를 통해 얻어지는 직경 500nm 크기의 섬유를 격자모양으로 무작위로 짜여진 얇은 막으로 형성할 수 있다. PHBV에 다양한 성분들 즉 교원질 또는 젤라 틴 등과 같은 성분을 함유시켜 제작한 PHBV 기반 나노섬유 막에 대한 조직공학적 지지체로서의 유용성이 여러 실험에서 긍정적으로 평가되고 있다.

PHBV-교원질 나노섬유막의 세포 부착 및 증식능 그리고 냉동보관성의 용이성과 효용성이 앞선 실험에서 확인되어 본 실험에서는 이들 세포-지지체 복합체의 조직공학적 골재생효 과와 골유도재생술의 효과를 평행시킴으로 골성회복을 극대 화하기 위한 일환으로 PHBV-교원질 나노섬유막에 백서 두개 골막에서 채취한 일차배양세포를 골성유도배양 조건하에서 골모세포로의 분화를 유도하였다. 골유도배양조건에서 일주 간 PHBV-교원질 나노 섬유막에 부착시켜 형성시킨 세포 -PHBV-교원질 나노섬유막 복합체를 대안적 차폐막으로 하 여 인위적으로 백서 경골에 형성한 5×2 mm 크기의 골결손 부에 이식하였다. 그리고 골막, 근육, 그리고 피부 순으로 층 별 봉합하였다. 세포가 부착된 PHBV-교원질 나노섬유막은 큰 어려움 없이 쉽게 조작할 수 있었으며, 이들 세포-지지체 복합체는 골결손부위에 무리없이 접합되었다. 그리고 봉합사 를 이용하여 골조직과 틈이 형성되지 않도록 긴밀히 고정할 수 있었다. 시술 3주 후 골재생 양상을 조직학적으로 비교 평가한 결과, 골결손부를 막으로 피개하지 않은 군보다 PHBV-교원질 나노섬유막을 차폐막으로 사용한 군에서 보다 양호한 골성회복을 보였으며, 특히 백서 두개골막세포를 부착 배양하여 이식한 군에서 더욱 양호한 골성회복 양상을 나타내 었다.

이와 같은 소견은 PHBV-교원질 나노섬유막이 골유도재생 술의 차폐막로서 효과가 인정될 뿐 아니라 세포 부착에 의한 조직공학적 접근이 골유도재생술의 효과를 상승적으로 배가 시킬 수 있음을 시사한다. 백서의 경우 두피가 얇아 넓은 두개 골로부터 쉽게 두개골막을 체취할 수 있고, 두개골막에 존재 하는 세포들이 골유도배양조건하에서 양호한 골성분화를 이 룬다는 점에서 이들 세포들이 조직공학적 골재생술에 좋은 세포 공급원이 될 수 있을 것으로 평가된다. 그러나 사람의 경우는 두피가 두꺼워 상대적으로 얇은 피부조직을 덮여 있는 경골의 골막을 활용하는 것이 효과적일 수 있다. 따라서 PHBV-교원질 나노섬유막을 골유도 재생술의 차폐막으로 활 용하여 상황에 맞게 골막 또는 골수, 치수, 지방 등과 같은 다양한 공급원으로부터 세포를 제공받아 부착‧배양시킴으로 써 세포-지지체 복합체를 형성하여 통상적인 골이식술 및 골 유도재생술에 조직공학적 재생효과를 부가시킴으로 골재생 효과를 극대화할 수 있을 것으로 기대된다.