I.INTRODUCTION

골조직은 양호한 재생능력을 지니고 있지만, 여러 원인으 로 골의 흡수가 과도하게 진행될 경우, 자생적 골재생을 이루 지 못하게 된다. 이런 경우 골이식과 같은 부가적인 시술이 요구된다. 지금까지 자가골 이식이 최선의 치료법으로 간주 되고 있으나, 최근들어 조직공학적 골재생술이 새롭게 각광 을 받고 있다^1,2).

조직공학적 골재생술에 3D 프린팅 기술이 적용되면서 다 양한 생체재료를 이용한 맞춤형 지지체 제작이 가능하게 되 었고, 여기에 골형성 세포를 효과적으로 부착 배양 시킴으로 써 보다 효과적인 골재생능을 유도하기 위한 다각적인 노력 이 경주되고 있다. 다공성 구조를 지닌 골재생용 지지체의 경우, 심부까지 세포를 적절히 유입시키는 것이 효과적인 골 재생의 선행 요구조건이 될 수 있다. 따라서 다양한 형태의 맞춤형 지지체의 경우에서도 이에 부합하는 최적화된 세포배 양법의 개발이 요구된다^3-5).

이에 본 연구에서는 골형성을 유도할 수 있는 세포들의 효과적인 보관과 지지체에 효과적으로 세포를 도입하기 위한 세포 배양기법 개발의 일환으로 PHBV를 전기방사하여 얻어 지는 직경 500nm 전후의 나노섬유를 그물구조의 섬유막으로 제작하여 세포 배양 및 부착 배양된 세포의 동결보관 효용성 등을 평가하였다.

II.MATERIALS AND METHODS

1.재료

조직공학적 골재생을 위한 세포의 증식 및 보관 효율성을 평가하기 위한 지지체로 생체적합성이 양호하고 생분해능이 우수한 PHBV(3-hydroxybutyrate- co-3-hydroxyvalerate)를 전기방사기로 직경 500nm 크기의 나노섬유로 방사하여 격자 모양으로 싸여진 나노섬유막을 이용하였다.

2.실험 방법

가세포 채취 및 보관

6주령 백서의 두개골을 노출시켜 조심스럽게 두정부 상방 의 골막 일부를 수술용 칼로 도려내어 1% collagenase와 0.5% dispase 혼합용액으로 세포를 분리하였다. 그리고 나노 섬유막 상방에 분주하여 통상적인 방법에 준하여 α-MEM (10%FBS + 1%P/S)배지를 이용하여 5% CO₂, 37°C 조건하에 서 1주일간 배양하였다. 배양된 세포를 일부는 세포 증식 및 분화 양상 관찰을 위해, 일부는 냉동저장후 효능성 평가를 위해 냉동저장 용액을 함유한 냉동보존용 튜브에 넣어, -2 0°C에서 1일, -80°C에서 10시간 경과 후, -170°C 액체질소에 2주간 냉동보관 하였다. 저장되었던 세포는 37°C 항온조에서 1~2분간 해동시켜, α-MEM(10%FBS + 1%P/S) 배지에서 다 시 3일간 배양하여 생활 증식성을 확인하였다.

나세포증식 양상 분석

분리된 두개골 골막유래 세포들을 나노섬유막이 삽입되어 있는 24well plate의 각 well에 각각 4×10⁴ 개의 세포를 파종 하고, 1일, 3일, 그리고 5일간 10% fetal bovine serum을 첨가 한 α-MEM 배지로 배양하였다. 그리고 통법에 따라 MTT assay 방법을 활용하여 세포의 수적 변화를 570nm 파장 대에 서 흡광분석기(Precision microplate reader, Molecular Devices, U.S.A)를 이용하여 분석하였다.

다골성 분화 정도 평가

골모세포로의 분화 양상을 평가하기 위해 두개골막 유래 세포를 PHBV 나노섬유막에 부착시켜 24well plate에서 골성 유도 배지 (10^-7M dexamethasone, 10mM β-glycerophosphate, 50μg/ml ascorbic acid, 10% FBS를 함유한 α-MEM 배 지)를 이용하여 배양한 다음, 2주째에 ALP 염색으로 골모세포 로의 분화 정도를, 그리고 3주째에 Alizarine red 염색으로 골 성분화 정도를 평가하였다.

III.RESULTS

가세포의 확보 및 저장 효용성

백서의 두개골막으로부터 세포의 확보는 비교적 손쉽게 이루어졌고, 세포의 회수율도 비교적 양호한 편이었다. 3×3 mm 크기로 수술용 칼로 먼저 절개선을 만들고 골막 분리용 겸자로 골막을 들어 올려 쉽게 얻을 수 있었으며, 효소처리하 여 낱개화된 세포들은 통상적인 배양 조건하에서 PHBV 나노 섬유막에 잘 부착되어 증식하였다(Fig. 1). 그리고 냉동 보관 되었던 세포를 해동시켜 재 배양하였을 때에 세포의 수적 감 소는 있었으나 비교적 양호한 회수율을 나타내었다.

나세포의 증식 양상

MTT 분석 결과, PHBV 나노섬유막에 부착되어 배양된 세 포들은 양호한 세포 증식양상을 보였으며, 냉동 보관되었던 세포들이 냉동 보관 되지 않은 조건의 세포들에 비해 상대적 으로 다소 낮은 세포 증식 양상을 나타내었다(Table. 1).

다백서두개골막 유래 배양세포의 골성 분화양상

동결보관 과정 없이 바로 PHBV 나노섬유막에 부착시킨 경우와 동결보관하였다가 재부착시켜 골성유도 배양조건에 서 2주간 배양한 경우 모두에서 백서 두개골막 유래 세포들 은 alkaline phosphates(ALP)의 양호한 활성을 보였으며, 골 성분화를 이룬 세포들은 ALP 염색에 반응하여 청색을 나타내 었다(Fig. 2). 또한 배양 3주째 Alizarine red 염색을 시행한 결과, 증식된 세포들 사이 사이에서 붉게 염색된 석회화 결절 들이 확인되었다. 비록 동결보관된 경우에서 ALP의 활성 및 석회화 결절 형성이 다소 감소되었으나 PHBV 나노섬유막에 부착 되어 동결보관될 경우 특별한 문제 없이 세포들의 골성 분화가 유도될 수 있음이 확인되었다.

IV.DISCUSSION

치조골 증대를 위해 일반적으로 사용되는 치과용 골이식 제는 사용부위에 대응하여 sponge형, membrane 형, 분말형, 과립형, 블록형, 젤형 등 다향한 구조로 개발되었으나 과립형 또는 분말형 골이식제가 통상적으로 활용되고 있다⁶⁾. 따라서 치조골의 특성상 경우에 따라 골결손부에 골이식체를 효과적 으로 위치시키는 것이 어려울 수 있어 차폐막 또는 혈장 등을 이용하여 골이식체를 피개해 주는 것이 효과적일 수 있다. 따라서 막성 지지체에 세포를 부착하여 통상적인 골이식제와 병용함으로써 치조골 재생 효과를 극대화 할 수 있을 것으로 기대된다.

조직공학용 지지체는 손상된 고유 조직을 재생하기 위한 임시적 구조체로서 궁극적으로 재생된 고유조직으로 완전 대 체되어야 한다^7-8). 따라서 조직공학용 지지체는 양호한 생체 적합성 및 생분해성이 요구된다. 그리고 효율적인 조직재생 을 도모하기 위하여는 세포들의 부착과 성장 그리고 분화를 위한 적합한 환경이 요구되며, 이를 위해서는 혈관과 조직의 유입이 용이한 일정 크기의 기공들이 상호 연결된 3차원 구 조가 바람직하다^9-11). 조직의 효과적인 재생을 위해서는 손상 된 고유조직을 형성할 수 있는 세포의 제공이 최우선적인 방 법이라 할 수 있다¹²⁾. 따라서 다양한 공급원으로부터 얻은 줄기세포를 지지체와 결합하여 효과적인 분화를 유도할 수 있는 방법의 확립이 요구된다.

이에 본 연구에서는 효과적인 조직공학적 골재생법 개발의 일환으로 생체적합성이 양호하고, 생분해능이 우수한 것으로 알려진 PHBV를 나노섬유 형태로 방사하여 격자모양으로 짜 여진 나노섬유막을 조직공학적 차폐막형 지지체로서의 효용 성을 평가하였다.

먼저 통상적인 in vitro 상태에서의 세포 적합성, 세포의 부착 및 증식성, 세포의 분화 유도 효과, 그리고 세포의 냉동 저장 효용성 등을 평가하였다. 예비실험에서 백서의 피하에 이식된 PHBV 나노섬유막은 서서히 특별한 이물반응 없이 분해 흡수 소실됨으로써 양호한 생체적합성이 확인되었다. 두개골막으로부터 세포의 획득은 통상적인 효소처리법으로 많은 양의 세포를 효과적으로 회수할 수 있었다. 이들 세포들 은 통상적 배양조건에서 양호한 증식능을 보였으며, PHBV 나노섬유막 상에서 배양된 경우 또한 양호한 증식 양상을 나 타내었다. PHBV 나노섬유막에 부착된 세포를 통상적인 냉동 저장용 용액에 넣어 2주간 비교적 짧은 기간 동안 냉동보관 한 경우, 이들 세포들의 활성유지는 양호하게 이루어졌다. 효소처리로 세포를 분리하여 통상적인 배양조건에서 새로운 PHBV 나노섬유막에 재부착시켜 배양한 경우와 해동시켜 바 로 배양한 경우 모두에서 양호한 세포증식 양상이 확인 되었 다. 비록 동결보관되었던 세포들이 동결되지 않았던 세포들 에 비해 세포증식 정도가 다소 감소되었지만 현저한 정도는 아니었다. 이와 같은 소견은 PHBV 나노섬유막의 양호한 세포적합성과 양호한 세포 부착 지지능과 더불이 PHBV 나노 섬유막이 양호한 세포저장용 지치체로 활용될 수 있음을 시 사한다.

PHBV 나노섬유막에 부착되어 골성유도 배양액에서 2~3 주간 배양된 백서 두개골막 유래 세포들은 양호한 골성 분화 를 나타내었다. 배양 2주째 ALP 염색에서 PHBV 나노섬유막 에 부착 배양된 다수의 세포들이 골모세포의 조기 표지자로 알려진 ALP의 활성을 보여 ALP 염색에 반응하여 청색을 나 타내었다. 냉동보관되었던 두개골막유래 세포들 역시 양호한 ALP 활성을 보였으나, 냉동보관되지 않은 군에 비해 숫적 감소를 보였으나 현격한 차이는 아니었다. 배양세포들의 골 성분화 정도를 확인하는 또다른 방법인 Alizarine red 염색법 에세도 배양 3주째 PHBV 나노섬유막에 부착되어 골성유도 배지상태에서 배양된 두개골막유래세포들은 Alizarine red에 붉게 염색되는 작은 석회화 결절들을 다수 형성하여 이들 세 포들의 양호한 골성분화를 다시 한번 확인 할 수 있었다. 따 라서 PHBV 나노섬유막에 세포를 부착시켜 냉동보관하는 방 법은 경우에 따라 여러부위의 동시적인 골증대술을 시행하지 못할 경우나 향후 추가적인 시술을 대비하여 세포를 저장할 경우 유용한 세포 저장법으로 활용될 수 있을 것으로 간주된 다. 그러나 이번 경우는 2주간 비교적 짧은 시간 저장한 경우 이므로 보다 장기적은 냉장 보관 효과는 추후 부가적인 실험 에서 파악되어야 할 것이다.

이상의 소견들을 바탕으로 PHBV 나노섬유막에 골막 유 래세포들을 부착배양하여 골유도재생술을 위한 흡수성 세포 부착 차폐막으로 활용함으로써 통상적인 골이식제를 이용한 골증대술에 부가적 효과를 제공하거나 골유도재생술 단독에 의한 치조골 골증대술에 있어 그 효과를 극대화 할 수 있을 것으로 기대된다.